SchB對UVA損傷HaCat保護作用的研究*

馬東東 曹 波 路婷婷 周玉杰 葛善珍 陳 虹 盧 濤

SchB對UVA損傷HaCat保護作用的研究*

馬東東1曹 波2路婷婷2周玉杰1葛善珍1陳 虹2盧 濤3△

目的 探討五味子乙素（SchB）對長波紫外線（UVA）誘導永生化人角質形成細胞（HaCat細胞）損傷后的保護作用及其可能的作用機制。方法用5 J/cm2的UVA照射HaCat細胞，給予不同濃度的SchB（0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L）處理UVA損傷后的HaCat細胞，檢測細胞超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，乳酸脫氫酶（LDH）及NO含量。結果UVA照射HaCat細胞后，SOD、GSH-Px活性降低，LDH及NO含量升高，給予不同濃度的SchB均能顯著提高SOD、GSH-Px活性，降低LDH及NO含量，提高HaCat細胞的存活率，尤其以0.001 μmol/L SchB的保護作用最強。結論0.001 μmol/L SchB減輕UVA對HaCat細胞損傷的效果最佳。

五味子素；紫外線；皮膚；細胞，培養的；HaCat細胞

隨著大氣臭氧層的破壞，紫外線對人體皮膚的損傷也越來越嚴重，主要包括長波紫外線（UVA，320～340 nm）和中波紫外線（UVB，290～320 nm）。UVA對皮膚的損傷程度高于UVB，其會導致皮膚真皮組織中的膠原及彈力纖維降解、皮膚光敏反應發生[1]、皮膚免疫功能降低[2]及皮膚腫瘤形成[3]。五味子乙素（SchB）可抑制大鼠肝臟質膜中丙二醛（MDA）的增加[4]，維持細胞在氧化損傷狀態下的穩定性。在四氯化碳引起大鼠肝細胞脂質過氧化損傷的模型中，SchB可使肝細胞MDA、乳酸脫氫酶（LDH）及丙氨酸轉氨酶（ALT）釋放減少，肝細胞的存活率明顯提高。SchB還可減輕過氧化氫（H2O2）對心肌細胞的氧化損傷，表現為MDA及LDH降低，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性增高[5]。但SchB在皮膚抗老化方面的研究較少。本研究旨在研究SchB是否對UVA照射后的永生化人角質形成細胞（HaCat細胞）有保護作用，并對其保護機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 NikonTS-100倒置顯微鏡；臺式紫外線輻射儀（上海，Sigma公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化臺，蘇州凈化設備有限公司；MCO-AC型CO2細胞培養箱，SANYO公司；多功能酶標儀，Thermo Scientific公司。DMEM液體培養基為天潤善大公司產品；胎牛血清（FBS）購自中國醫學科學院血研所科技公司；二甲基亞砜（DMSO）考馬斯亮藍G250為FLUKA公司產品；胰酶（Trypsin）、DMSO購于GIBECO公司。SchB相對分子質量400，由天津武警后勤醫學院生藥學教研室陳虹教授研究室提供，體外實驗用DMSO配制。

1.2 實驗分組及照射方法 將盛有傳代HaCat細胞的培養瓶放入5%CO2孵箱中培養，10%FBS的低糖DMEM培養，每天換液。實驗設對照組（不經UVA照射）、模型組（UVA照射劑量為1、5、10、15 J/cm2）及ShcB 1～4組（UVA照射后分別加入ShcB 0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L）。UVA波長為320～400 nm，照射距離為1 cm。倒去各組的細胞培養液，PBS洗2次，再加入適量的冷PBS覆蓋，照射后加入無血清的培養液繼續培養，通過檢測細胞存活率來確定合適的照射強度。采用合適強度UVA處理HaCat細胞，給予不同濃度的SchB處理UVA損傷后的HaCat細胞。

1.3 噻唑藍（MTT）實驗 取對數生長期HaCat細胞，胰酶消化后制備細胞懸液，調整濃度為1.5×105個/mL，每孔100 μL的細胞懸液加入96孔板中，培養36 h后做UVA處理，每組設6個復孔。ShcB組UVA照射2 h后加入不同濃度SchB。所有研究組繼續培養24 h后，每孔加入50 μL的MTT，37℃5% CO2孵箱培養4 h后，加DMSO 4 h，在震蕩儀上震蕩4 min后在酶標儀550 nm處測定光密度（OD）值，計算細胞存活率=1-（對照組OD值-模型組OD值）/對照組OD值。

1.4 氧化損傷實驗 取對數生長期HaCat細胞，胰酶消化后制備細胞懸液，調整濃度為1×105個/mL，鋪到10 cm的培養皿中培養，設對照組、模型組、ShcB 1～4組，放入5%CO2孵箱中，培養36 h后，用5 J/cm2的UVA照射2 h，ShcB 1～4組給藥，繼續培養24 h后，取上清液酶生化法測定細胞外的GSH-Px、雙氧化物歧化酶（SOD）、LDH和NO的含量。

1.5 統計學方法 用SPSS 17.0進行統計學分析。實驗數據均用±s表示，各組之間均數的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UVA實驗照射劑量的確定 對照組和1、5、10、15 J/cm2模型組HaCat細胞的存活率分別為（100.00± 6.31）%、（98.10±5.78）%、（75.05±8.64）%、（66.10± 5.61）%和（53.71±2.59）%，差異有統計學意義（F= 18.805，P＜0.01）。隨UVA照射劑量增大，HaCat細胞存活率逐漸降低，預實驗發現細胞存活率低于70%時，再加用SchB時受損HaCat細胞幾乎不再增殖，GSH-Px、SOD、LDH、NO幾乎無差別，不符合實際情況，故選擇5 J/cm2作為實驗照射劑量。

2.2 不同濃度SchB對UVA損傷后HaCat細胞的保護作用 SchB 3組細胞存活率最高，但隨SchB濃度降低，藥物的保護作用減弱，見表1。

2.3 不同濃度SchB對HaCat細胞GSH-Px、SOD、LDH、NO含量的影響 與對照組比較，模型組的GSH-Px、SOD活性降低，LDH、NO含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，SchB 1～4組均能提高SOD活性，降低LDH、NO含量，除SchB 4組外，SchB 1～3組均能提高GSH-Px活性，見表1。

3 討論

UVA輻射可誘導細胞產生活性氧簇（ROS）。ROS攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸，發生脂質過氧化反應，產生更多的ROS，導致皮膚細胞DNA的光損傷[6]，表現為皮膚的表皮和真皮層的損傷。

Table 1 Effects of different concentrations of SchB on cell survival rates and laboratory indexes of HaCat cells表1 不同濃度的SchB對HaCat細胞存活率及實驗室指標的影響 （n=6±s）

Table 1 Effects of different concentrations of SchB on cell survival rates and laboratory indexes of HaCat cells表1 不同濃度的SchB對HaCat細胞存活率及實驗室指標的影響 （n=6±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組SchB 1組SchB 2組SchB 3組SchB 4組F NO (μmol/L) 0.17±0.04 0.38±0.03a0.26±0.03b0.21±0.04b0.19±0.02b0.27±0.05b1 852.481＊＊細胞存活率（%）100.00±3.12 77.11±3.33a91.78±6.47b92.52±5.39b98.39±3.23b90.61±5.78b11.071＊＊GSH-Px（μmol/L）7.16±0.18 2.54±0.34a3.17±0.18b4.95±0.15b8.34±0.33b3.01±0.28 117.232＊＊SOD（U/mL）8.47±0.50 3.22±0.15a6.73±1.98b6.78±1.22b7.79±1.22b5.68±1.37b8.853＊＊LDH (U/mL) 3.34±0.03 7.80±1.06a5.79±0.68b4.49±0.01b4.00±0.98b6.02±0.26b59.406＊＊

SchB為五味子中的單體活性成分，其可以清除肝細胞中的自由基及脂質過氧化物，并可提高肝細胞中抗氧化物酶的表達。侯微等[7]研究發現，SchB可以減輕H2O2造成HaCat細胞的氧化應激損傷，從而起到一定的保護作用，與本實驗的結果相似。本實驗通過檢測皮膚的保護性指標SOD、GSH-Px的含量和損傷性指標LDH、NO的含量發現，隨著SchB濃度的降低，其對HaCat細胞保護作用越強，當濃度降到0.001 μmol/L時，保護作用最強。因此不是SchB濃度越高，保護作用就越強，0.001 μmol/L的SchB為最適濃度，過高及高低的濃度保護效果均不佳，原因有待相關試驗進一步分析。

[1]Smith E,Kiss F,Porter RM，et al.A review of UVA-mediated photosensitivity disorders[J].Photochem Photobiol Sci,2012，11(1):199-206.

[2]梁俊琴，普雄明.紫外線與皮膚免疫[J].中國免疫學雜志，2009，25(9)：863-865．

[3]Halliday GM,Byrne SN,Damian DL.Ultraviolet A radiation：its role inimmunosuppression and carcinogenesis[J].Semin Cutan Med Surg,2011,30(4):214-221．

[4]Lu H,Liu GT.Anti-oxidant activity of dibenzocyclooctene lignans isolated from Schizandrae[J].Planta Med,1992,58(4):311-313.

[5]汪云開.五味子乙素對過氧化氫損傷心肌細胞的保護作用[J].中國中西醫結合急救雜志,2012,19(1)：5-8.

[6]Fisher GJ,Kang S,Varani J,et al.Mechanisms of photo aging and chronological skin aging[J].Arch Dermatol,2002,138(11):1426-1470.

[7]侯微,魏忠寶,高薇,等.五味子甲素乙素及丙素對HaCat細胞氧化損傷的保護作用研究[J].安徽農業科學,2013,41(3)：1047-1049．

（2013-08-07收稿 2013-10-23修回）

（本文編輯 魏杰）

The Protective Effect of Schisandrin B on the Damage of Immortal Human Keratinocytes Induced by UVA

MA Dongdong1,CAO Bo2,LU Tingting2,ZHOU Yujie1,GE Shanzhen1,CHEN Hong2,LU Tao3
1 Hebei United University,Tangshan 063009,China;2 Tianjin Armed Police Logistics Department,School of medicine；3 Armed Police Hospital of Tianjin Institute of Dermatology Logistics

ObjectiveTo explore the protective effect of schisandrin B(SchB)on the permanent damage of human keratinocytes(HaCat)induced by long wave ultraviolet(UVA)，and its possible mechanism thereof.MethodsAfter HaCat was treated by 5 J/cm2UVA,different concentrations of SchB(0.1,0.01,0.001 and 0.000 1 μmol/L)were used to treat HaCat cells.The levels of superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px)activity,lactate dehydrogenase(LDH)and NO content were detected.ResultsThe levels of SOD and GSH-Px activity were decreased,and he levels of LDH and NO content were increased in HaCat cells after being treated by UVA.The different concentrations of SchB showed significant effects on the increased levels of SOD,GSH-Px activity and decreased levels of LDH and NO,and improved the survival rate of HaCat cells.The 0.001 μmol/L SchB showed the strongest protective effect.ConclusionThe 0.001 μmol/L SchB showed the best effect on the damage of HaCat cells induce the UVA.

SCHIZANDRIN;ultraviolet rays;skin;cells,cultured;HaCat cells

R758.1

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.002

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：81072964）

1河北聯合大學（郵編063009）；2天津武警后勤學院生藥教研室；3天津武警后勤學院附屬醫院皮膚科

△通訊作者 E-mail:48144051@qq.com