高效液相色譜串聯質譜法測定紅糖中3-硝基丙酸

高裕鋒，龐揚海，甄振鵬，黃敏興，余構彬，郭劍雄

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2國家糖業質量監督檢驗中心，廣東廣州510316)

0 引言

3-硝基丙酸可由霉變甘蔗中的病原菌甘蔗節菱孢霉產生，是一種強烈的嗜神經毒素，可對中樞神經系統產生嚴重的損傷[1-3]。人在攝入含有3-硝基丙酸的食物后，首先經胃腸道吸收，隨后分布于肝、腎組織中，且能透過血腦屏障進入腦組織并富集[3]。紅糖是目前市面上較受歡迎的食糖品種之一，其生產工藝比較簡單，保留了原料甘蔗的很多物質，紅糖的質量安全問題一直是人們關注的熱點[4-5]。如果紅糖的生產過程使用了霉變甘蔗進行加工，有可能導致3-硝基丙酸在紅糖中殘留，引發食品安全風險，因此開發紅糖中3-硝基丙酸的檢測方法具有重要的意義。

目前，針對甘蔗中3-硝基丙酸的檢測方法有離子色譜法、毛細管電泳法、液相色譜法、高效液相色譜串聯質譜法等[6-10]，對于食糖產品中的檢測方法并無報道。與色譜方法比較，高效液相色譜串聯質譜法可實現準確定性且具有較高的靈敏度[10]。本文將采用超高效色譜串聯質譜法建立紅糖中3-硝基丙酸的檢驗方法，并對目前市面上銷售的紅糖中殘留情況進行了初步的調研。該方法操作簡單，檢出限和靈敏度符合食品安全檢驗的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯質譜儀AB 5500 Q-Trap (美國AB SCIEX公司)；超純水機UPC-I-60L型(成都超純科技有限公司)；大容量冷凍離心機CL5R(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；多位試管渦旋振蕩器Multi Reax(德國 Heidolph公司)；超聲波清洗機SB25-12 DTD (寧波新芝生物科技股份有限公司)；氮吹儀N-EVAP112 (美國Organomation公司)；電子天平JE3002GE(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

3-硝基丙酸(99.99%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；甲酸(分析純，廣州化學試劑廠)；甲醇(色譜純，德國默克股份兩合公司)；無水乙醇(分析純，廣州化學試劑廠)；氨水(25%，廣州化學試劑廠)；0.22 μm有機相濾膜(彼西絡科技(廣州)有限公司)；PWAX固相萃取柱(天津博納艾杰爾科技有限公司)。所用紅糖樣品均在市面隨機購買。

1.2 標準溶液配制

準確稱取3-硝基丙酸標準品10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，10%甲醇-0.1%甲酸水混合溶劑定容，配制成質量濃度為1000 mg/L的標準儲備液，于 4℃條件下保存。取上述標準儲備液逐級稀釋，用 10%甲醇-0.1%甲酸水定容，配制成濃度為 20、10、5、1、0.5、0.2、0.1 μg/L 的溶液。

1.3 提取和凈化

準確稱取2.00 g紅糖樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙醇-水(9∶1)，充分渦旋5 min，在4900 r/min轉速的離心機下離心5 min；取3 mL上清液于50 mL離心管中，加入3 mL超純水，充分渦旋5 min，待凈化。PWAX固相萃取柱先加入3 mL甲醇，再加入3 mL超純水活化后，取4 mL試樣溶液過柱，先用5 mL超純水淋洗，再用10 mL 10%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液。經氮氣吹干后，用2 mL10%甲醇-0.1%甲酸水復溶，超聲20 min，過0.22 μm濾膜至進樣瓶中，待LC-MS/MS檢測。

1.4 LC-MS/MS分析

1.4.1 LC條件

色譜柱：Luma Omega C18柱(1.6 μm，100 mm×2.1mm)，柱溫 40℃；進樣量：2 μL；流動相 A：超純水，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件

電離模式：ESI-；儀器參數：氣簾氣壓力 40.0 kPa，碰撞氣壓力中檔，離子噴霧電壓-4500.0 V，離子源溫度550℃，霧化氣壓力50.0 kPa，輔助加熱氣壓力 50.0 kPa，接口加熱器為開；采集模式：多反應監測MRM，具體參數如表2所示。

2 結果與討論

2.1 色譜和質譜條件選擇

由于使用反相色譜柱對 3-硝基丙酸進行分離時，3-硝基丙酸具有很強的酸性和親水性，在反相柱上保留較弱，因此需要使用磷酸二氫鉀溶液作為流動相。但是液相質譜聯用對不揮發性鹽類耐受性較差，一般情況下禁止使用任何不具有揮發性的緩沖鹽作為流動相，所以本實驗考察了適合保留極性物質的色譜柱 ACQUITY UPLC HSS T3和 Luma Omega C18對3-硝基丙酸分離效果。圖1顯示，就保留時間而言，2種色譜柱均在1.50 min左右，但從峰型來看，T3柱的峰型稍有拖尾，且對稱性不如C18柱，故最終選用Luma Omega C18作為色譜柱。

質譜條件優化方法是：在注射泵直接進樣的條件下，在負離子模式下進行母離子全掃描，確定3-硝基丙酸的分子離子峰，然后以該分子離子峰為母離子，對其子離子進行全掃描，獲得二級質譜響應較強的子離子，最后以多反應監測模式進行采集，并獲得去簇電壓和碰撞能量等相關參數，具體參數如表2所示，使所測的質譜峰強度最優。

表2 3-硝基丙酸的MRM質譜參數

圖1 3-硝基丙酸標準溶液(10 μg/L)的MRM譜圖

2.2 提取方法和凈化方式選擇

通過加標回收試驗，比較不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙醇-水作為提取溶劑對回收率的影響，綜合考慮溶劑的毒性和價格，選用乙醇-水(9∶1)作為提取溶劑。

紅糖基質主要是蔗糖和其他有色雜質，需要對樣品進行凈化處理才能得到較高的回收率，并保護色譜柱。3-硝基丙酸是一種極性小分子且具有酸性、親水性等特性，選用混合型弱陰離子交換小柱PWAX固相萃取柱作為凈化柱。該固相萃取柱對強酸性化合物有很好的選擇性，可以起到富集除雜的效果。樣品經PWAX固相萃取柱富集后需要通過淋洗來除去雜質，從而達到凈化的目的。淋洗劑通常選擇甲醇、水或甲醇-水混合溶劑，回收率試驗表明(如表3所示)，以甲醇-水混合溶劑作為淋洗液都可以達到90%以上的回收率，綜合考慮溶劑的毒性和水對蔗糖基質的去除效果，選擇以水作為淋洗劑。

2.3 方法線性范圍和檢出限

表3 淋洗液中甲醇含量對3-硝基丙酸回收率的影響

用0.1～20.0 μg/L標準工作溶液進樣分析，根 據標準物質濃度(x)和峰面積(y)計算的線性方程見表4。結果表明，3-硝基丙酸標準曲線的相關系數為1.0000，線性良好。方法檢出限(LOD)以空白樣品基質稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比S/N=3計算得出。定量限(LOQ)是以空白樣品基質稀釋標準曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比S/N=10計算得出。3-硝基丙酸檢出限0.057 μg/kg，定量限為0.189 μg/kg(表4)，可以滿足3-硝基丙酸痕量分析的需要。

表4 3-硝基丙酸的方法檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關系數

2.4 回收率和精密度

分別準確添加3-硝基丙酸標準溶液于陰性紅糖樣品中，設3個添加濃度，每個濃度分別做6次重復實驗，按上述方法測定，以得到的平均回收率評價分析方法的準確度，以6次測試結果的相對標準偏差評價方法的精密度。添加水平為 2.5、10、50 μg/kg，平均添加回收率在 79.2%～85.5%之間，相對標準偏差在 5.2%～7.3%之間(見表 5)，符合殘留分析的要求。

2.5 實際樣品測試

表5 紅糖中3-硝基丙酸平均回收率和精密度數據表(n=6)

按上述方法檢測了在市面上隨機購買的 20份紅糖樣品，其中19個樣品未檢出3-硝基丙酸，有1個樣品檢出，檢出值為1.16 μg/kg。這表明一方面霉變甘蔗產生的 3-硝基丙酸有可能殘留到紅糖產品中；另一方面，3-硝基丙酸的人體中毒劑量為12. 5 mg/kg[8]，以成人體重60 kg計算，中毒劑量約為750 mg，據此推算該紅糖的殘留值在正常食用條件下不會對人體造成中毒的危害。

3 結論

通過對前處理方法和色譜質譜條件的優化，建立了紅糖中3-硝基丙酸的高效液相色譜串聯質譜檢測方法，結果表明，3-硝基丙酸在 0.1～20 μg/L濃度范圍內線性關系良好，該方法的檢出限為 0.057 μg/kg，定量限為 0.189 μg/kg，在 2.5、10、50 μg/kg的加標水平下，平均回收率為79.2%～85.5%。該方法前處理簡單，檢測靈敏度高、準確性好，可用于紅糖中3-硝基丙酸的批量檢測。