UPLC-MS/MS法測定植物飲料中蘆薈苷含量

林奕云，鄭家概，付 強，丁少曼，肖可茵，盧嘉豪

(中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

蘆薈苷，又稱蘆薈大黃素苷或蘆薈素，是蘆薈的主要活性成分。蘆薈不僅有抗炎、抗輻射等功效，還能夠抗癌變、抗衰老、調節血糖[1-2]。近年來，隨著人們健康養生意識的提高，植物飲料受到越來越多人的青睞，涼茶等天然植物飲料銷量迅速增長[3]。以蘆薈為原料的植物飲料的相關產品標準和法規尚未出臺，只對植物飲料原輔料的要求中提到不得使用或添加非食品用原料[4-5]，然而，《歐盟食品中化學污染物限量規定》對飲料中蘆薈苷的限值為0.1 mg/kg。因此，建立植物飲料中蘆薈苷準確、靈敏的檢測方法，具有重要的意義。

目前關于蘆薈苷的檢測方法有：分光光度法[6]、薄層掃描法[7]、液相色譜法[8-10]、液相色譜-串聯質譜法[11-12]等。由于飲料中的蘆薈苷含量很低，高效液相色譜-串聯質譜聯用法具有靈敏度高、專屬性強等特點。因此，為有效監控蘆薈苷在植物飲料中的含量，本文優化了液相色譜條件、質譜條件，建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜(UPLC-MS/MS)法測定植物飲料中蘆薈苷含量的分析方法。該方法靈敏度高、回收率和重現性良好、結果準確可靠，可以檢測植物飲料中低含量的蘆薈苷，為控制產品質量提供數據及技術手段支持。

1 實驗部分

1.1 儀器設備與試劑

Agilent 1290/6460A超高效液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀，美國安捷倫科技公司；Sartorius BSA224S 電子天平，德國賽多利斯科學儀器有限公司；XW-80A型微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器有限公司；KQ-2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

蘆薈苷(Aloin，CAS：1415-73-2，純度：97.71%)購自成都普菲德生物技術有限公司；乙腈，色譜純，美國Honeywell公司；甲醇，分析純，購自廣州化學試劑廠；實驗用水為去離子水。

1.2 標準溶液配制

準確稱取10.0 mg蘆薈苷標準品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

稱取樣品5.0 g于25 mL棕色容量瓶中，加入15 mL甲醇，渦旋，混合均勻后超聲提取10 min，冷卻至室溫，用水定容至25 mL，過0.22 μm濾膜上機測定。

1.4 基質匹配標準曲線的配制

稱取5份空白基質樣品，分別加入適量標準溶液，按照1.3進行處理，制成濃度為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL的基質匹配標準工作液。

1.5 色譜/質譜測定條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)；流動相A為乙腈，B為水；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量5.0 μL；梯度洗脫程序如下：0～3.0 min，40%～90%A，3.0～3.5 min，90%A，3.6～5.0 min，40%A。

1.5.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，采用負離子電離模式，掃描方式為多反應監測模式(MRM)。干燥氣溫度為300 ℃，干燥氣流量5 mL/min，霧化器壓力40 psi，鞘流氣溫度350 ℃，鞘流氣流量11 mL/min，毛細管電壓3500 V。蘆薈苷的MRM參數列于表1，安捷倫MassHunter軟件用于定性和定量分析。

表1 蘆薈苷的MRM參數 Table 2 MRM parameters of Aloin

注：*表示定量離子對。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

分別以乙腈-水、甲醇-水作為流動相，考察對目標化合物離子化程度的影響。結果表明，以乙腈-水作為流動相時，蘆薈苷的響應值明顯高于流動相為甲醇-水時的響應值。因此，選用乙腈-水作為流動相。

目標化合物的離子化效率還會受到流動相中加入的添加劑影響[13]。比較在水相中分別加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨對目標化合物離子化效率的影響。結果發現，本實驗水相中加入甲酸或乙酸銨，都抑制了離子化效率，蘆薈苷響應值均有所降低，因此，試驗采用乙腈-水作為流動相，進行梯度洗脫。

比較了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)和SB-C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)的分離效果。結果顯示：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱的分離時間較短，蘆薈苷峰形尖銳對稱、不拖尾。

2.2 質譜條件的優化

使用1.0 μg/mL蘆薈苷標準溶液進樣，分別在ESI+、ESI-的模式下進行全掃描，掃描發現在負離子模式下，蘆薈苷的靈敏度更高，因此，選擇擇負離子模式，m/z 417.0作為蘆薈苷測定的母離子。采用SIM掃描方式，優化出最佳碎裂電壓，146 V條件下，蘆薈苷母離子的響應最高。再采用Product Ion掃描方式，蘆薈苷經碰撞后產生的碎片離子有m/z 297.0 和m/z 268.0，其中m/z 297.0相對豐度最高，作為定量離子，m/z 268.0作為定性離子。最后，優化出子離子的最佳碰撞能量，得到表1所示的質譜參數。最終優化了質譜條件，得到如圖1所示的蘆薈苷標準溶液的MRM色譜圖，如圖2所示的陽性樣品和陰性樣品的總離子流TIC圖。

圖1 蘆薈苷的多反應監測(MRM)色譜圖

Fig.1 MRM Chromatograms of Aloin

圖2 樣品的總離子流(TIC)色譜圖Fig.2 TIC Chromatograms of samples

2.3 線性范圍

本文采用基質匹配外標法定量，以消除基質干擾，提高定量準確性。按照1.4配制基質匹配標準曲線，以蘆薈苷的質量濃度(x)為橫坐標，色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制工作曲線。結果表明，蘆薈苷在1.0～25 ng/mL的質量濃度范圍內線性回歸方程為Y=5641.3X-265.5，相關系數r≥0.9995，具有良好的線性關系，表明該方法適用于植物飲料中蘆薈苷的定量分析。

2.4 檢出限和定量限

蘆薈苷的的檢出限為1.0 μg/kg(信噪比S/N=3)，定量限為3.0 μg/kg(信噪比S/N=10)。

2.5 回收率和精密度

準確稱取3份空白樣品，每份5.0 g，加入蘆薈苷標準溶液，添加量為5.0 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg，按照1.3方法進行樣品處理。每個添加水平測定6次，考察方法的精密度。從表2可以看出，在5、10和25 μg/kg這3種加標水平下目標化合物的平均回收率為91.2%～95.3%，相對標準偏差(RSD6)為3.15%～6.10%，表明方法的準確度和重復性較好，可滿足日常分析要求。

表2 蘆薈苷的回收率和相對標準偏差(n=6) Table 2 Spike recoveries and RSD of Aloin in blank samples (n=6)

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯質譜法測定植物飲料中蘆薈苷含量的方法，樣品經甲醇提取，基質匹配外標法定量，降低了基質干擾，提高了分析靈敏度。該方法靈敏度高、回收率和重現性良好、結果準確可靠，可以檢測植物飲料中低含量的蘆薈苷，為控制產品質量提供數據及技術手段支持，為植物飲料中非法添加非食品用原料的風險監測研究提供了可靠的檢測手段。