柑桔胚乳培養體系的建立與優化

李海林 聶振朋 柯甫志

摘要：利用Minitab軟件正交試驗設計L9（33），以Ms培養基，分別加入不同質量濃度的6-BA.2，4-D、對柑桔胚乳愈傷組織誘導;以Ms培養基，分別加入不同質量濃度TDZ和NAA對愈傷組織誘導不定芽。結果表明：柑桔愈傷組織誘導最佳組合為6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L，愈傷組織誘導率可達30%;柑桔不定芽誘導最佳組合為TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose40g/L，不定芽誘導率可達35%。

關鍵詞：柑桔;胚乳;正交試驗

我國是柑桔的重要原產地之一，柑桔資源豐富，優良品種繁多，經過長期栽培、選擇，柑桔成了人類的珍貴果品。柑桔果實既可鮮食，又可加工成果汁，深受廣大消費者的喜愛。我國柑桔品種資源雖然豐富，但栽培的品種多是有核甚至多核的，因而影響了商品價值和在國際市場上的競爭力Ⅲ。

無核柑桔果實以其食用方便、品質優良而倍受人們的青睞，其無論在鮮食和加工上都具有重要意義。無核柑桔，育種上指平均單果種子數在3粒以下，在商業上指平均單果種子數在5粒以下。柑桔無核果有很多是天然形成的，但大部分無核品種是人為選育出來的。胚乳是雙受精產物之一，由1個精核和2個極核融合而成，是三倍體組織，由胚乳再生的植株通常也是三倍體，可產生無子果實。通過胚乳培養獲得三倍體植株，技術要求不高，三倍體得率高，嵌合體少，育種周期短，柑桔胚乳的離體培養是獲得三倍體無籽柑桔的重要途徑。通過研究柑桔胚乳三倍體植株的誘導，以期獲得無核的三倍體胚乳再生植株。

1材料與方法

1.1試驗材料

柑桔果實取自臺州科技職業學院果園，以果齡2個月左右的柑桔幼果為宜。

1.2試驗方法

1.2.1幼果處理。將新鮮果實，用70%乙醇浸泡30s，再用0.1%HgCI2溶液浸泡6～7min，然后用無菌水沖洗3-4次，每次3～5min。再用干燥的無菌濾紙吸干種子表面的水分后，然后將果實放在滅菌培養皿內。

1.2.2取胚乳。用流水沖洗預處理后的柑桔幼果30min左右，剝離出種子，將種子用0.1%HgCl2消毒6～7min。再用無菌水沖洗4～5次，每次3～5min。在超凈工作臺無菌條件下，在種子的合點端縱剖1刀，打開種子取出胚囊。輕輕擠壓胚囊的胚端，擠出幼胚，剝離出胚乳，選擇半透明狀固體、富有彈性的胚乳，單獨接種。

1.2.3愈傷組織誘導。所用培養基以MS為基本培養基，對6-BA、2，4-D、sucrose濃度利用Minitab軟件正交設計優化。正交設計的因素及水平分別為6-BA濃度（0.5、1.0、1.5mg/L），2，4-D濃度（0-2、0.4、0.6mg/L），sucrose（20、40、60g/L）（見表1）。每個處理接種10瓶。及時對其進行形態觀察，50～60d后統計愈傷組織誘導率。愈傷組織誘導率=愈傷組織塊數/接種個數。

1.2.4不定芽誘導。獲得胚乳愈傷組織增殖培養后，接種于不定芽誘導培養基。以MS培養基為基本培養基，對TDZ、NAA、sucrose濃度利用Minitab軟件正交設計優化。正交設計的因素及水平分別為TDZ濃度（0.5、1.0、1.5mg/L），NAA濃度（0.1、0.2、0.3mg/L），sucrose（20、40、60g/L）（見表2）。每處理每次接種20塊愈傷組織。不定時觀察愈傷組織動態變化，50～60d后統計不定芽發生情況。

1.2.5組培苗倍性鑒定。將不定芽接種于MS培養基中，培養2-3周成苗。利用流式細胞儀對組培苗倍性進行鑒定。鑒定方法參照陳城報道的方法。

培養基pH值5.8-6.2。培養條件均為：溫度25°C，光照時間為12h/d，光照強度為2000Lx，瓊脂0.7%，活性炭濃度1.0mg/L。

2結果與分析

2.1愈傷組織誘導

由表4可知，3種因子對柑桔愈傷組織誘導產生效應的大小依次為6-BA>2，4-D>sucrose。說明同種類培養基中，不同濃度的6-BA對柑桔愈傷組織誘導的影響較大，2，4-D次之，而sucrose的影響較小。鑒于以上分析，結合表3可知：柑桔愈傷組織誘導最佳組合為A2B1C2，也就是蔗糖6-BA 1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L+sucmse 40g/L，愈傷組織誘導率可達30%。

2.2不定芽誘導

由表6可知，3種因子對不定芽誘導產生效應的大小依次為TDZ>NA>sucrose。說明同種類培養基中，不同濃度的TDZ對柑桔愈傷組織誘導的影響較大，NAA次之，而sucrose的影響較小。鑒于以上分析，結合表5可知：柑桔不定芽誘導最佳組合為A1B1C2，也就是TDZ 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L，不定芽誘導率可達35%。

2.3植株形成與鑒定

不定芽在MS培養基培養2～3周形成再生植株。鑒定結果如圖1。

3結論

Gmitter及趙詠望等早在20世紀90年代就從甜橙品種的胚乳中誘導出了三倍體植株。本試驗采用正交設計，研究不同激素的種類、濃度及其配比對柑桔組織培養的影響，與傳統試驗相比，本試驗能容納更多的因素和水平，大大減少了試驗次數，提高準確率。利用流式細胞儀鑒定植物染色體的倍性，不受植物生長發育時期和環境條件的影響，取材部位可以是根、莖、葉片、花、果實、種子等器官，具有快速、準確、簡單、高效的特點。已經成功應用于果樹、蔬菜、花卉等植物的倍性鑒定中。試驗結果表明，不同的激素配比對柑桔胚乳愈傷組織和不定芽的誘導有很大的影響。本試驗中柑桔愈傷組織誘導最佳組合為：6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.2mg/L+sucrose 40g/L，愈傷組織誘導率可達30%;柑桔不定芽誘導最佳組合為：TDZ0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+sucrose 40g/L，不定芽誘導率可達35%。