甜瓜果面茸毛、果面瘤以及果面溝全基因組關聯(lián)分析

胡倩梅 楊會會 朱華玉 胡建斌 楊路明

摘? ? 要： 為尋找調控果面茸毛、果面溝以及果面瘤表型變異的位點，調查200份甜瓜種質在2017年和2018年的表型，并對這200份種質進行全基因組重測序，利用全基因組關聯(lián)分析的方法對其進行關聯(lián)。結果在3號染色體上找到了一個與果面茸毛顯著相關的SNP;在11號染色體上找到了2個與果面溝顯著相關的SNP，在5號、7號和11號染色體上各找到了一個與果面溝深顯著相關的SNP;在12條染色體上均找到了與果面瘤顯著相關的SNP，所有與果面瘤顯著相關的SNP標記中有8個標記顯著性遠遠高于其他標記。進一步對果面茸毛的1個顯著SNP，果面溝的5個顯著SNP和果面瘤的8個SNP進行了基因注釋，共計找到了146個基因。研究結果有助于甜瓜果面茸毛、果面瘤以及果面溝性狀的快速精細定位，也將為甜瓜果實遺傳改良提供重要參考依據。

關鍵詞： 甜瓜;果面茸毛;果面溝;果面瘤;全基因組關聯(lián)分析

Genome-wide association analysis of fruit fluff， fruit surface tumor and fruit surface ditch in melon

HU Qianmei1， YANG Huihui1， ZHU Huayu1，2， HU Jianbin1，2， YANG Luming1，2

（1.College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： Based on the phenotyping and re-sequencing of 200 melon germplasms， the genome-wide association analysis was used to identify loci associated with fruit villi， fruit sulcus， and fruit surface tumors in melon. These traits were investigated of 200 melon germplasms in 2017 and 2018， and genome-wide resequencing of these 200 germplasms was conducted for SNP detection. As a result， 1 SNP was found on chromosome 3 that was significantly associated with fruit fluff. 2 SNPs were found on chromosome 11 that were significantly associated with the fruit surface ditch. There was only 1 SNP was found significantly associated with the fruit surface ditch on the chromosome 5， 7 and 11， respectively. SNPs that were significantly associated with fruit surface tumors were found on all 12 chromosomes. Among of them， 8 SNPs had much higher significantly associated than the other SNPs， therefore those SNPs were used in further study. Totally 14 SNPs were detected associated for fruit villi， fruit sulcus， and fruit surface tumors， and 146 genes flanking these SNP were annotated. The SNPs significantly associated withthese traits will be helpful to quickly and finely locate candidate genes， and will also provide an important reference for the genetic improvement of melon fruit.

Key words： Melon; Fruit fluff; Fruit groove; Fruit surface tumor; Genome-wide association analysis

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科（Cucurbitaceae）作物，染色體數為2n=2x=24。甜瓜屬于喜溫、喜光植物，在28～32 ℃范圍內可以正常生長，低于13 ℃即停止生長[1]。甜瓜營養(yǎng)物質含量豐富，是世界十大水果之一。甜瓜自身的表型多樣性極其豐富，不同類型的甜瓜在果面茸毛、果面瘤、果面溝、果皮顏色、果肉顏色、瓜瓤顏色、種子顏色、果面網紋、可溶性固形物含量、葉片形狀等諸多方面有很大的差異，其多樣性在葫蘆科植物中僅次于南瓜。2012年甜瓜全基因組測序結果公布，基因組大小為454 Mb，預測共有27 427個基因[2]，為開展甜瓜分子育種研究提供了極大的便利。在過去的十幾年間大量的研究工作者對甜瓜的果皮顏色、果面覆紋、果肉顏色、果肉含糖量、果實質量、果實長度、果實寬度、果肉厚度、葉面積、葉片缺刻、種子寬度、種子長度以及種子質量[3-14]等農藝性狀做了深入研究，然而對成熟果實的茸毛自然脫落、果面瘤和果面溝所做的研究還相對較少。

果面茸毛是指果實成熟后果皮表面的茸毛，與先前Palomares-Rius等[15]所研究的TypeⅠ型茸毛以及Zhu等[16]所研究的無毛突變體均不同。果面瘤是指成熟果實表面的瘤狀物凸起，先前研究中多認為該性狀是由環(huán)境引起的，但筆者在研究中發(fā)現部分材料較易產生果面瘤，而部分材料則不易產生果面瘤;果面溝指成熟果實表面的凹陷，我們一般將果面溝分為果面溝有無、果面溝淺和果面溝深這3個性狀，果面溝影響甜瓜的果皮結構、果實受力以及裂果，王學征等[17]通過構建6世代定位到1個與果面溝形成相關的基因。

全基因組關聯(lián)分析（ GWAS）是指在全基因組范圍內，通過高密度的SNP標記挖掘控制表型性狀變異基因座的統(tǒng)計分析方法。關聯(lián)分析的方法最早應用于人類相關疾病case-control研究中[18]，受人類疾病遺傳學研究的啟示，GWAS也被運用到作物遺傳和育種研究中并取得重要進展[19-20]，本研究通過對200份甜瓜種質進行重測序，利用 GWAS的方法對成熟果實果面茸毛的脫落、果面瘤、果面溝有無、果面溝淺以及果面溝深這5個性狀進行研究，以期能夠找到真正造成表型變異的突變位點。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自于從世界各地收集的200份甜瓜種質，包括88份厚皮種質，91份薄皮種質和21份野生種質，其中11份種質由胡建斌收集，77份種質來源于美國農業(yè)部，112份種質來自于中國農業(yè)科學院鄭州果樹所。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗 本研究田間試驗于2017年、2018年在河南農業(yè)大學科教園區(qū)毛莊試驗基地的塑料大棚進行。2月中旬進行溫湯浸種催芽，材料播種于72孔穴盤，在日光溫室中進行育苗。所有材料3葉1心時進行定植，每年設置2個重復，每個重復內每份材料定植4個單株。田間水、肥以及整枝按照常規(guī)管理。所有材料于果實成熟時期進行性狀調查和統(tǒng)計，調查標準參考《甜瓜種質資源描述規(guī)范和數據標準》[21]的標準與方法進行統(tǒng)計、分級和賦值。

1.2.2 測序樣品制備 植株定植30 d后，采用混合采樣法，每個材料混合采取4個單株的幼嫩葉片3～5 g，采用真空冷凍干燥器將葉片抽干，并用高通量組織粉碎機將葉片打磨成粉末狀備用。提取總DNA，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 全基因組重測序 200份甜瓜種質的測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成，采用Illumina測序技術。測序完成后過濾掉帶接頭的reads、N含量超過10%的reads以及質量值低于10的堿基超過50%的reads。

1.2.4 SNP標記的檢測與篩選 采用GATK（V4.0.9.0）call SNP[22]，將雙端read和單端read都作為 call SNP的初始reads數據。

1.2.5 群體遺傳學分析 應用利用GCTA （V1.91.2）進行主成分分析，保留前3個特征向量，以其作為協(xié)變量放入全基因組關聯(lián)分析模型中[23];利用GAPIT進行親緣關系分析親緣關系矩陣（K）[24]作為隨機效應加入到全基因組關聯(lián)分析模型中;LD值由PopLDdecay（V3.40）進行計算，用r?值來確定LD衰減距離。

1.2.6 全基因組關聯(lián)分析 為減弱性狀的復雜性對關聯(lián)結果的影響，除去果面茸毛和果面瘤外，我們將果面溝分為果面溝有無、果面溝淺和果面溝深進行關聯(lián)分析。本研究利用GAPIT中的一般線性模型（GLM）、混合線性模型（MLM）、壓縮混合線性模型（CMLM）和多位點混合線性模型（MLMM）4個模型同時對5個性狀進行關聯(lián)，利用BH矯正進行篩選顯著SNP，將同時在 5個模型中關聯(lián)到的SNP標記進行后續(xù)分析。

1.2.7 SNP注釋 根據公布的甜瓜基因組CM3.6.1_pseudomol.fa （V3.6.1）和注釋文件CM4.0.gff3（V4.0）對獲得的全基因組SNP進行注釋。

2 結果與分析

2.1 全基因組重測序與SNP標記過濾

200份甜瓜種質的全基因組重測序共計獲得1 849 Gb的clean測序數據，平均測序深度為22 X。通過GATK對SNP的過濾，共計獲得2 989 591個SNP標記。

2.2 連鎖不平衡分析

通過對200份種質材料進行LD衰減分析（圖1），結果表明群體衰減距離為60 kb，將在檢測到的顯著SNP前后30 kb分析候選基因[25]。

2.3 全基因組關聯(lián)分析

關聯(lián)分析能夠通過計算每個SNP位點與目標性狀關聯(lián)的可信值，從而對調控目標性狀的位點進行預測，筆者通過對果面茸毛、果面瘤、果面溝有無、果面溝淺和果面溝深這5個農藝性狀進行GLM、MLM、CMLM和MLMM等4種關聯(lián)模型全基因組關聯(lián)分析，發(fā)現果面茸毛有1個SNP（圖2-A），位于3號染色體;果面瘤檢測到了105個SNP（圖2-B）在12條染色體均有分布;果面溝有無檢測到了2個SNP（圖2-C），位于11號染色體;果面溝淺沒有檢測到SNP（圖2-D），果面溝深檢測到3個SNP（圖2-E），分別位于5號、7號和11號染色體。其中果面溝有無和果面溝深均檢測到了標記chr11_24130439，果面瘤檢測到的顯著SNP中chr7_8087384、chr8_10804573、chr12_19247259、chr7_21474816、chr4_32540139、chr4_3278835、chr9_23361283和chr2_9400335這8個SNP的顯著性最高，其P值分別為1.16E-53、1.80E-53、2.23E-47、1.96E-45、1.12E-37、6.33E-29、5.69E-24和1.16E-20，基于此對SNPs的注釋中針對果面瘤我們著重研究這8個顯著性最高的SNP（表1）。

2.4 SNP的注釋

基于甜瓜基因組注釋在14個SNP上下游區(qū)域30 kb測到146個基因，果面茸毛獲得10個相關基因，果面溝有無獲得14個基因，果面溝深獲得33個基因，果面瘤獲得89個基因。經比對分析我們發(fā)現在果面瘤茸毛顯著SNP標記chr3_256240260附近檢測到的基因MELO3C011492.2和纖維素的分解、膜的組成以及纖維素酶的活性均有關聯(lián);與果面溝顯著相關的SNP標記chr11_24130439附近檢測到基因MELO3C019697.2和細胞的組成部分以及伸長相關，標記chr05_24592367附近檢測到基因MELO3C004136.2能夠調控細胞的單方向生長，標記chr07_2180656附近的基因MELO3C016777.2對分生組織的生長和纖維素微纖維組織均有調控作用;與果面瘤相關的SNP標記chr4_3278835附近的基因MELO3C003679.2和細胞質的組成成分相關。

3 討 論

3.1 甜瓜全基因組關聯(lián)分析

自2012年甜瓜基因組序列發(fā)表以來，利用全基因組關聯(lián)分析的方法研究甜瓜相關性狀的研究也相繼發(fā)表，但其在甜瓜中的應用還比較薄弱，所用標記和關聯(lián)的性狀均較少。2015年齊振宇[9]利用14 689個SNP標記對構建的F2群體的6個性狀進行全基因組關聯(lián)分析，在1號和10號染色體檢測到與節(jié)間長度相關的SNP位點，在1、4和8號染色體檢測到與側枝長相關聯(lián)的SNP位點，在1、3、4、8、11和12號染色體檢測到與葉面積相關的SNP位點，在10號染色體檢測到與果皮顏色相關的SNP位點，在2號染色體上檢測到與甜瓜抗白粉病相關的SNP。2016年Nimmakayala等[26]利用13 756個SNP標記通過GWAS和QTL連鎖作圖相互驗證的方法將甜瓜果肉硬度定位到6、8、9、11和12號染色體。2017年王艷玲等[27]利用104個SSR標記對果實相關性狀進行全基因組關聯(lián)分析，將果實縱徑、果實橫徑、果形指數、果肉厚度和果實鮮質量分別關聯(lián)到10、5、9、8和10個SSR標記。本研究所用SNP標記數遠遠高于以上研究在甜瓜全基因組關聯(lián)分析中所用的標記數，研究中所關聯(lián)的性狀還未發(fā)現有學者對其用全基因組關聯(lián)分析的方法研究過，本研究豐富了甜瓜在全基因組關聯(lián)分析方面的研究。

3.2 關聯(lián)模型比較

Q-Q圖可以通過判斷圖形中的點分布是否合理，進而推斷出所用的統(tǒng)計模型是否合理。一般Q-Q圖有兩種比較合理的模型，第1種是觀測值與期望值相同，第2種是Q-Q圖的左下角期望值與觀測值一致，右上角有少量位點高高翹起，超過期望值。第1種表明沒有找到與性狀顯著相關的SNP，第2種是在進行關聯(lián)分析中所期望得到的關聯(lián)結果，左下角期望值與觀測值一致表明了模型的合理性，右上角少量標記超出了期望值，表明對所關聯(lián)性狀關聯(lián)到了與性狀顯著相關的SNP標記。筆者同時應用了4種關聯(lián)模型，由本研究中的5個性狀結果圖可以看出一般線性模型和混合線性模型均有大量的標記觀測值高于期望值，顯然這是不符合生物學邏輯的。而壓縮混合線性模型和多位點混合線性模型從Q-Q圖上來看一方面比較符合生物學邏輯，另一方面這兩個模型的一致性比較高，從側面驗證的檢測到的顯著性標記具有較高的可信度。

3.3 關聯(lián)結果

果面茸毛、果面瘤以及果面溝是影響甜瓜外觀品質和商業(yè)品質的重要因素，定位調控果面茸毛、果面瘤以及果面溝的基因位點可以揭示這3類性狀的遺傳機制，為利用分子育種技術培育外觀品質和商業(yè)品質優(yōu)異的新品種奠定基礎。目前關于甜瓜茸毛的報道僅有2篇，Palomares-Rius等[15]所研究的Type I型茸毛主要表現為茸毛短小，且主要是對葉片的研究，Zhu等[16]所研究的無毛突變體在整個生育期整個植株上均表現為無毛，而本研究的果面茸毛僅在果實成熟期開始脫落，基于該性狀對果實幼果的保護，是一個重要的農藝性狀，目前尚且沒有學者對其進行研究，筆者在200份甜瓜種質中關聯(lián)到的位點（chr3_25624260）與前兩位學者所關聯(lián)到的位點（11號染色體和8號染色體）完全不同，說明這些性狀是由不同位點控制的。王學征等[17]將果面溝QTL_qGroove-1-1定位到11號染色體末端的1.1 cM的區(qū)間內，這與本研究中關于果面溝所檢測到11號染色體上的SNP標記比較接近，同時我們在5號的7號染色體發(fā)現了新的和果面溝顯著相關的位點，可能果面溝并不是一個簡單的質量性狀，推測其可能是由多個位點進行調控的數量性狀，這與王學征等[17]所認為的果面溝是由一對等位基因調控的結果所不同。甜瓜果面瘤的性狀目前還沒有學者進行研究。盡管本研究檢測到了156個與表型顯著相關的SNP，但沒有對所檢測到的SNP附近基因進行定量分析，無法確定所獲得的標記附近基因對表型的調控模式，仍需后續(xù)研究對其進行深入分析研究。

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