進境美國高粱種子中產黃色鐮孢菌的檢測與鑒定 王 藝 周密密 孫民琴 等（74）

王藝 周密密 孫民琴 郭曉駒 李彬 吳翠萍

摘要：從進境的美國高粱種子中分離到一株疑似產黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）的菌株A009。該菌株菌落形態和顯微特征均與產黃色鐮孢菌一致。基于雙基因位點（ITS、EF-1α）進行最大似然分析，構建系統發育樹。結果表明，菌株A009與Fusarium thapsinum（Gibberella thapsina）聚集在一個分支上，最大相似度為100%。致病性測試表明，菌株A009接種高粱幼苗葉片，4 d后在接種部位出現萎蔫癥狀。根據上述試驗結果，將進境美國高粱種子中的菌株A009鑒定為產黃色鐮孢菌。

關鍵詞：產黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）;高粱病害;形態特征;系統發育分析;致病性測試

中圖分類號：S41-30? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）08-0074-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.08.017? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The isolate A009 was obtained from Sorghum bicolor seeds imported from America. It was similar to Fusarium thapsinum in morphology. The results of phylogenetic analysis based on double gene（ITS and EF-1α） locuses showed the isolate A009 clustered within the type strain of Fusarium thapsinum （Gibberella thapsina）. The maximum likelihood was 100%. Pathogenicity test showed that it caused leaf spot and wilt on inoculated sorghum seedlings after 4 days. Based on all above results， the isolate A009 was identified as Fusarium thapsinum.

Key words： Fusarium thapsinum; sorghum diseases; morphological characters; phylogenetic analysis; pathogenicity test

高粱[Sorghum bicolor （L.） Moench]為禾本科一年生草本植物，全世界第五大作物，位于小麥、水稻、玉米和大麥之后，是重要的糧食作物和飼料作物[1]。目前，中國進口的高粱主要來自美國和澳大利亞，主要用作飼料加工及釀酒原料等。2017年，中國從美國進口高粱達476萬t，占總進口量的94%，貿易額約為9.57億元。

鐮刀菌（Fusarium spp.）是一類世界性分布的重要植物病原真菌，侵染谷物可引起萎蔫、根腐、穗腐、莖腐等癥狀，造成嚴重的經濟損失[2]。同時，鐮刀菌產生的真菌毒素對人和動物的健康都存在潛在的威脅。據報道，以高粱為寄主的鐮刀菌主要包括產黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、甘蔗鐮刀菌（Fusarium sacchari）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、串珠鐮孢菌亞粘團變種（Fusarium moniliforme var. subglutinans）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）、高粱鐮刀菌（Fusarium andiyazi）、擬輪生鐮刀菌（Fusarium verticillioides）、錯綜赤霉菌（Gibberella intricans）和玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）等[3，4]。

鐮刀菌種類繁多，形態各異，對這些真菌的鑒定大多基于形態學和雜交可育的標準，不僅費時，還需要有非常專業的鐮刀菌分類學和生理學知識。同時，根據形態學建立的分類系統很難對其進行準確的分類鑒定。而基于DNA的分子檢測方法具有快速、靈敏和特異等優點，其中多種基因位點已被廣泛用于鐮刀菌屬及種間的鑒定，這些基因位點包括內轉錄間隔區（ITS）、β-微管蛋白（β-tubulin）、翻譯延伸因子（EF-1α）、線粒體小亞基核糖體（mtSSU）等[5-7]，目前應用最多的是ITS和EF-1α基因[8]。

2018年5月，從一批南通口岸進境美國的高粱種子樣品中分離獲得了一株疑似產黃色鐮孢菌菌株A009，通過形態觀察、多基因位點系統發育分析，并運用柯赫氏法則（Kochs postulates）進行了致病性測定，對該批高粱攜帶的病菌進行了檢測和鑒定。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

供試材料為2018年1月進境的美國高粱種子，樣品編號為18P0505。致病性測定的寄主為健康的美國高粱幼苗，接種苗齡為三葉期。

試劑主要包括植物總DNA提取試劑盒（Tiangen）、Tris-HCL（pH 8.0）、2% CTAB提取液、TE緩沖液、PCR反應試劑、瓊脂糖、PDA培養基、次氯酸鈉消毒液。

1.2? 病原菌的分離與純化

在體視顯微鏡下用鑷子挑取高粱種子中呈黑褐色的病變樣品，用于病原菌分離。將樣品在次氯酸鈉溶液中表面消毒3～5 min，再用無菌水漂洗3次，以去除表面殘留的次氯酸鈉，用滅菌后的吸水紙吸干種子的水分，風干后加入含抗生素（青霉素和硫酸鏈霉素，100 μg/mL）的PDA培養基中。每皿放入7～8顆樣品種子，置于25 ℃恒溫培養箱進行培養。觀察真菌菌落生長情況，將長出的菌落及時轉移到新的PDA培養基上純化培養。用滅菌后的打孔器（直徑5 mm）打取菌絲塊，置于PDA平板上繼續培養，觀察并測量病菌的生長情況。

1.3? 病原菌的形態鑒定

觀察和記錄PDA平板上的真菌菌落形態、顏色及氣生菌絲的疏密程度，測量菌落的生長速度，用高清數字成像設備（D810，日本尼康公司）拍攝菌落形態特征。在全自動萬能顯微鏡（Axio Imager M1，德國Zeiss公司）下觀察其顯微形態特征，使用AxioVision Rel.4.5軟件測量其分生孢子的大小，根據病菌的形態特征進行鑒定。

1.4? 分子鑒定

1.4.1? 基因組DNA提取? 采用CTAB法提取病菌基因組DNA。將獲得的菌株接種于PDA平板上培養7 d，用解剖刀刮取適量菌絲于2 mL Eppendorf離心管內，加入兩顆直徑3 mm的鋼珠，在低溫破碎儀（Retsch，MM400）上以30 f/s速度研磨5 min，研磨后加入500 μL CTAB，振蕩后12 000 r/min離心10 min，65 ℃孵育1～2 h。加入酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，取400 μL上清，加400 μL氯仿，振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，取上清約400 μL，加280 μL異丙醇，-20 ℃放置30 min，振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，棄上清，加300 μL 75%乙醇，振蕩混勻后12 000 r/min離心5 min，棄上清，晾干后加50～200 μL TE緩沖液溶解DNA，獲得病菌基因組DNA工作液用于PCR擴增。

1.4.2? 基因組序列擴增? ITS擴增引物為ITS1和ITS4[9]，EF-1α擴增引物為EF-1和EF-2[10]（表1）。反應體系包括Premix Taq 25 μL，DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，去離子水補足50 μL。反應條件為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃/56 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸7 min后4 ℃保存。

1.4.3? 序列分析? 對A009菌株的PCR擴增產物進行雙向序列測定，并將得到的序列在GenBank中進行BLAST分析。同時，從GenBank中下載13個鐮刀菌ITS、EF1-α基因序列（表2），采用Clustal X進行序列比對[11]，并用軟件MEGA 7.0采用最大似然法進行系統發育分析[12]。

1.5? 致病性測試

采用針刺接種法進行致病性測試。菌株A009在PDA上培養14 d后產生大量分生孢子，用解剖刀刮取分生孢子，用無菌水配制成5×105個孢子/mL的懸浮液。在營養缽中生長至3～4片真葉期的健康高粱幼苗，用接種針在葉片中間和邊緣部位穿刺傷口，用少量脫脂棉蘸取菌懸液覆蓋在傷口部位，并用無菌水接種作為對照。將接種后的幼苗用塑料薄膜保濕48 h，之后在室溫（25 ℃）下培養，觀察記錄發病情況。對發病幼苗進行病菌的再分離。

2? 結果與分析

2.1? 病原菌形態特征

在PDA培養基上，菌株A009從高粱種子表面長出時，菌落呈風輪狀，氣生菌絲白色，絨毛狀;菌落從上而下呈黃色或褐色，色素沉著不均勻（圖1A、圖1B）。經繼代培養后，菌落正面變為淡黃色，上面有深褐色斑點，反面呈黃褐色（圖1C、圖1D）。菌株在PDA培養基上生長速度很快，25 ℃培養6 d后菌落直徑達57～76 mm，平均以10 mm/d的速率生長。菌株以假頭狀方式產生大量的小型分生孢子，分生孢子無色，橢圓形或卵圓形，無隔膜或1～2個分隔，平均大小為12 μm×2.4 μm（圖1E，圖1F）。在PDA培養基上，菌株A009未產生大型分生孢子。菌株A009以上特征與Klittich等[13]描述的產黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）形態特征一致。

2.2? 序列分析

對菌株A009采用EF-1α和ITS相應的引物分別進行PCR擴增和雙向測序，將獲得的序列與其他參試鐮刀菌相關序列（表2）采用CLustal X進行序列比對，并用軟件MEGA 7.0進行最大似然分析，發現基于EF-1α基因構建的最大似然樹A009與Fusarium thapsinum聚集在一個分支的支持率為68%（圖2a），基于ITS基因構建的最大似然樹A009與Fusarium thapsinum聚集在一個分支的支持率為65%（圖2b），說明此病原菌與Fusarium thapsinum的親緣關系比較近，但由于病原菌與近緣種在系統進化樹上同在一個分支且無法再分，單獨根據EF-1α或ITS序列系統發育樹尚無法準確判斷病原菌的種級分類水平，因此采用雙基因位點進行最大似然分析。結果表明，菌株A009與Fusarium thapsinum（Gibberella thapsina）聚集在一個分支上，支持率為100%。

2.3? 致病性測定

運用柯赫氏法則對分離的菌株進行致病性測定。結果（圖3）表明，接種的高粱幼苗葉片上，2 d后葉片接種部位呈現水漬狀;接種4 d后，水漬病斑從葉片中間向兩端發展迅速，接種部位縊縮，呈萎蔫狀，并出現少量菌絲體。而用無菌水接種的對照葉片未出現發病癥狀（圖3）。對上述接種植株的發病組織進行病原菌的再分離，所獲得的菌株與原始菌株A009菌落形狀、形態特征及序列分析結果均一致。

3? 小結與討論

通過對高粱種子中分離到的菌株A009培養性狀及形態學觀察、PCR產物序列比對、系統發育分析和致病性測試，將菌株A009鑒定為產黃色鐮孢菌。

產黃色鐮孢菌[有性態（Gibberella thapsina）]是1997年在鐮孢菌李瑟組中建立的一個新種[13]。該種在形態上雖然與同組的其他鐮刀菌相似，但是在產生的真菌毒素、同工酶多態性、電泳核型、對苯菌靈的敏感性以及在核糖體DNA的ITS區域序列等方面與其他種具有顯著差異。

目前，對于鐮刀菌屬及種間的鑒定，通常以形態學為基礎，并結合多種基因進行分子檢測。ITS序列因其片段較短、物種間變異性強、易擴增測序等優點被廣泛用于真菌的分類研究，也是真菌鑒定的通用條形碼。但是對于親緣關系較近的鐮刀菌而言，ITS序列同源性很高，還是難以通過該基因準確鑒定到種。

據柳鳳等[14]報道，EF-1α基因在鐮刀菌的系統發育和進化水平上具有豐富的信息量，并且在該屬的真菌內，未發現該序列的非直系同源拷貝，可以應用于鐮刀菌系統發育學的鑒定。另外，有很多學者已將此基因位點用于鐮刀菌的鑒定[15-17]。雷婭紅等[18]報道選擇nrDNA-ITS、EF-1α、mtSSU和β-tubulin 4個候選基因對11種57株鐮刀菌的基因序列進行分析。結果表明，EF-1α基因PCR擴增與測序成功率高，種間差異明顯大于種內差異，構建的系統發育樹顯示相同種聚集在同一分支，不同種劃分在不同分支，可作為鐮刀菌屬鑒定的DNA條形碼。Sampietro等[19]報道通過TEF1-a測序可以對Fusarium subglutinans、Fusarium andiyazi和Fusarium thapsinum 3個種進行明確地鑒定。

鐮孢菌是農作物上最重要的病原真菌類群之一，在高粱上可引起莖腐病、頂腐病、粒霉病等多種病害[20]，無論從植物病理學，還是從食品安全的角度分析，對高粱子粒上攜帶的鐮孢菌進行分類鑒定都具有非常重要的意義。Fusarium thapsinum可以侵染高粱的莖稈、種子、根冠等部位，是高粱種子的主要致病菌之一。該病菌不僅導致產量大幅度下降，而且也使子粒品質變劣，造成較大的經濟損失。

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收稿日期：2018-09-17

基金項目：國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2017IK155）;江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2017KJ08）

作者簡介：王? 藝（1996-），女，江蘇泰州人，在讀碩士研究生，研究方向為植物檢疫，（電話）18305176727（電子信箱）2017802155@njau.edu.cn;通信作者，李? 彬（1972-），男，主要從事植物檢疫工作，（電話）13815871522（電子信箱）libin_1103@163.com。