副干酪乳桿菌的分離鑒定及腸道耐受性研究

印伯星

（1.揚州大學，食品科學與工程學院，江蘇揚州225009，2.江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225004，3.江蘇省乳業生物工程技術研究中心，江蘇揚州225004）

0 引 言

乳酸菌作為一類能夠利用糖類生長并產生乳酸的益生菌[1]，因其具有保護人體腸道健康等益生作用引起了人們的高度關注。乳酸菌包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸菌和酵母菌屬等，其中乳桿菌數和雙歧桿菌屬被廣泛應用于發酵乳產業中[2]。副干酪乳桿菌廣泛存在于奶酪、泡菜等發酵食品中，其益生作用經過了多年的實踐檢驗[3]。Chen[4]等人利用副干酪乳桿菌發酵乳飲料，發現其在發酵后能夠促進腸上皮細胞的生長，并且降低腫瘤壞死因子-α（TN F-α）的產生。曹永強[5]等人利用副干酪乳桿菌N 1115發酵乳進行動物實驗，研究結果表明攝入副干酪乳桿菌N 1115發酵乳后小鼠腸道內短鏈脂肪酸含量顯著增多，有效改善了小鼠的便秘情況。但是由于副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌的親緣關系非常近，傳統的生理生化特性以及16S rDNA序列很難將其進行區分[6]。因此，需要針對副干酪乳桿菌的特異性基因進行鑒定，才能將其與干酪乳桿菌進行有效區分。

本研究從西藏傳統乳制品中分離出35株乳酸菌，經16S rDNA序列測序比對后，初步將其中15株乳酸菌鑒定為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌群。再利用特異性基因recA[7]序列進行鑒定分析后，將其中5株確定為副干酪乳桿菌，隨后對菌株環境耐受性進行研究，為開發商業發酵劑和副干酪乳桿菌的鑒定提供了參考。

1 試 驗

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株與試劑

15株分離自西藏傳統乳制品中的干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌群，M RS培養基，溶菌酶，2×Taq PCR M aster mix，DL 2000 DNA m arker，牛黃膽酸鈉，鹽酸，胃蛋白酶，胰蛋白酶，碳酸氫鈉等，化學試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

BCN 1360型生物潔凈工作臺，DHP-9272型電熱恒溫培養箱，7000 PCR擴增儀，DYY-10C型電泳儀，TGC-16G型離心機，Delta320 pH計等。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離及保藏

在無菌條件下，取傳統發酵乳制品樣品100μL或0.1 g于900μL無菌生理鹽水（0.85%，w/v）中，振蕩混勻，得到10-1cfu/m L的菌懸液。然后對菌懸液進行10倍梯度稀釋，將稀釋好的樣品分別接種于滅菌M RS固體培養基，置于37℃恒溫培養箱中厭氧培養48～72 h，菌落形成后觀察并記錄菌落形態。隨后選取生長狀態良好、菌落形態不同的單一典型菌落接種于液體M RS培養基中，在37℃厭氧條件下培養18～24 h，對菌株進行多次劃線純化。然后挑取單一菌落進行革蘭氏染色和鏡檢，將確定為革蘭氏陽性的菌株繼續活化，并對其進行過氧化氫酶試驗。若菌株為革蘭氏陽性菌，過氧化氫酶陰性，則將其暫定為乳酸菌，并進行保種，以便進行后續試驗。

1.2.2 16S rDNA序列鑒定

首先采用改良的Chelex[8]方法對分離菌株DNA進行提取，其方法如下：（1）取2 m L培養至對數期的菌液（菌液濃度為108cfu/m L），12 000 r/min，離心2 min，棄掉上清，收集菌體。（2）取1 m L生理鹽水反復洗滌菌體3次，12 000 r/min，離心2 min，棄掉上清。（3）菌泥中加入提取液（25%Chelex?100，0.5%NP40，1×TE緩沖液配制，pH=9.0），進行56℃孵育30 min。（4）將上述混合液煮沸10 min，12 000 r/min，離心2 min，取上清液，即為DNA，保存于-20℃直至使用。用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的菌株DNA進行檢測。

隨后以菌株DNA作為模板進行PCR擴增，引物采用細菌16S rDNA的通用引物27F和1492R，序列如下：27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'；1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，采用50μL反應體系。PCR反應條件如下：94℃預變性5 min，95℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR完成后進行16S rDNA測序，對測序結果進行比對分析。

1.2.3 recA基因引物設計及擴增

本研究通過比較基因組學分析Lb.paracasei ATCC 334的全基因組序列，選取recA基因作為特異性靶基因進行特異性引物設計，以區分干酪乳桿菌及副干酪乳桿菌[9]。recA基因引物設計結果如下：

表1 引物序列

PCR反應條件為94℃預變性5 min，95℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR擴增完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，對擴增產物進行測序后進行比對分析。

1.2.4 環境耐受性試驗

1.2.4.1 耐酸性試驗

2代活化的菌懸液于10 000 g，4℃離心5 min，然后用PBS清洗3次菌泥，按3%的接種量接種于HC l調整后p H值為3.0的液體M RS培養基中，37℃培養，分別取0、1、2、3 h時的菌液稀釋涂布，以新鮮MRS培養基為空白對照，計算存活率。

1.2.4.2 耐膽鹽試驗

按3%的接種量將菌懸液接種于膽酸鹽濃度為0.3%的MRS液體培養基中，37℃培養0、1、2、3和4 h時，分別取100μL樣品進行10倍梯度稀釋，取適當梯度的稀釋液進行涂布計數，以新鮮MRS培養基為空白對照，計算存活率。

1.2.4.3 人工胃腸液耐受性試驗

活化2代的菌懸液離心后用PBS清洗3次，將菌泥重懸于經濾膜過濾除菌的人工胃液（0.35%胃蛋白酶、0.3%N aC l、調整至p H 3.0）中，37℃分別培養0、1、2、3 h時取100μL菌液稀釋涂布，用平板菌落計數法計算活菌數，測定菌株在酸性胃液條件下的耐受性。當菌體在人工胃液中處理3 h后，吸取1 m L含菌人工胃液，加入至9 m L經濾膜過濾除菌的人工腸液（1.1%碳酸氫鈉、0.3%N aC l、0.1%胰蛋白酶、0.6%膽鹽，調整至p H 8.0）中，于37℃培養，分別在0、3、5、7、8 h時吸取100μL菌液稀釋涂布，用平板計數法計算活菌數，測定菌株在腸中的耐受性。以新鮮M RS培養基為空白對照，計算存活率。

1.2.5 數據統計分析

每個試驗樣品設置3組平行，結果取平均值，利用M EGA軟件對分離菌株的16S rDNA序列和recA基因序列進行系統發育分析，采用O rigin軟件作圖分析。

2 結果與討論

2.1 菌株分離及16S rDNA測序

從傳統乳制品中分離出35株待定乳酸菌，進行16S rDNA測序，測序結果顯示編號1到15的菌株全部為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌，運用通用引物進行PCR所獲得的序列進行系統發育樹的構建（圖1），發現無法區分菌株種屬。

2.2 recA引物擴增結果

利用副干酪乳桿菌特異性基因recA設計特異性引物，對15株16S rDNA測序結果為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌的菌株進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，發現存在清晰條帶。隨后針對測序結果進行Blast比對，確定其中5株為副干酪乳桿菌，分別編號為KY 1、KY 2、KY 3、KY 4和KY 5。利用M ega軟件將5株分離株與標準菌株(Lb.paracasei ATCC 334、Lb.paracasei ATCC 25302、Lb.paracasei JCM 8130、Lb.casei ATCC 393)的recA序列構建系統發育樹，從圖2中可以發現，5株分離株與副干酪乳桿菌親緣關系更近，說明recA基因可以較好的區分親緣關系較近的干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌。

圖2 基因序列的系統發育樹

2.3 耐酸性試驗

人體中胃液的p H一般在2.5～3.5之間，食物在胃中的消化時間一般為1～3 h，因此選擇p H值3.0作為試驗條件來評價菌株對酸的耐受性。針對5株篩選出的副干酪乳桿菌進行耐酸性試驗，試驗結果如下圖3所示。由圖3可知，在pH值為3.0的MRS中生長3 h后，副干酪乳桿菌KY 1、KY 2的存活率仍達到30%以上，說明KY 1、KY 2對酸性環境有較強的耐受性，因此選取副干酪乳桿菌KY 1和KY 2作為后續試驗的試驗菌株。SKask[10]等人研究了從奶酪中分離出的副干酪乳桿菌在內的6株乳酸菌，研究結果發現副干酪乳桿菌在酸性條件下具有更高的生長速率。

圖3 副干酪乳桿菌KY1-5對酸的耐受性（pH3.0）

2.4 耐膽鹽試驗

本試驗選取膽鹽濃度為0.3%的M RS，分別作用0、1、2、3、4 h后通過平板計數評價菌株對膽鹽的耐受性。結果如圖4所示，可以看出副干酪乳桿菌KY 1和KY 2對膽鹽均具有很高的耐受性，在3 h時菌株存活率可達到69.1%和64.9%。膽鹽濃度的選擇是由于正常人體腸道內膽鹽濃度最接近于0.3%[11]，因此本研究的耐受性試驗具有較高的實際意義。

圖4 副干酪乳桿菌KY1、KY2對膽鹽的耐受性（0.3%）

2.5 耐人工胃液試驗

人體胃液呈酸性，其中還含有一些酶類物質，其酸性環境和酶類物質對于乳酸菌發揮益生功能作用具有很強的抑制作用[12]，因此對胃腸液具有高耐受性的益生菌發酵劑具有很高的工業應用價值。本研究選取通常情況下胃中p H值為3.0的條件下，處理0、1、2、3 h后，進行菌落計數，評估菌株對人工胃液的承受能力。試驗結果如圖5所示，模擬人工胃液處理3 h后，KY 1和KY 2的存活率分別為15.1%和13.2%。

圖5 副干酪乳桿菌KY1、KY2對人工胃液的耐受性

2.6 耐人工腸液試驗

食物經過胃部消化后進入腸道，腸道中的菌群生長會受到多種成分的影響，益生菌需要有能力耐受腸道內的胰蛋白酶及堿性環境才能夠發揮其益生作用。小腸內的pH一般在7.6左右，食物在小腸內會停留3～8 h[13]。因此，本試驗選取pH 8.0的人工腸液處理0、3、5、7、8 h后，通過平板計數檢測副干酪乳桿菌KY 1和KY 2對人工腸液的耐受性。結果如圖6所示，兩株副干酪乳桿菌KY 1和KY 2在模擬人工腸液中處理8 h后存活率能夠分別維持到48.9%和48.3%，可見這兩株副干酪乳桿菌都具有很好的人工腸液耐受能力。

圖6 副干酪乳桿菌KY1、KY2對人工腸液的耐受性

3 結 論

本研究針對西藏傳統乳制品中分離出的35株乳酸菌進行了16S rDNA測序和特異性recA基因擴增，確定其中5株為副干酪乳桿菌，并發現recA序列可以較好的區分親緣關系較近的干酪乳桿菌與副干酪乳桿菌。再針對這5株副干酪乳桿菌進行耐受性評價，試驗結果表明副干酪乳桿菌KY 1、KY 2具有較高的酸耐受性，膽鹽耐受性和人工胃腸液耐受性，意味著兩株副干酪乳桿菌KY 1、KY 2具有較高的潛力成為工業化發酵劑。