低水平乙型肝炎病毒DNA 慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒RNA 水平及其影響因素研究

彭亞夢(mèng)，袁浩*，周毅峰，龍貞亦，吳思弦

目前乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球最嚴(yán)重、最普遍的健康問題之一［1］。每年因HBV 感染而導(dǎo)致其肝功能失代償、肝硬化、肝衰竭及肝細(xì)胞癌等相關(guān)疾病死亡的患者有50 萬～120 萬人［2-3］。導(dǎo)致HBV 持續(xù)性感染的根本原因是共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的持續(xù)性存在［4］，現(xiàn)有的血清標(biāo)志物和病毒學(xué)復(fù)制分子學(xué)檢測(cè)難以準(zhǔn)確反應(yīng)肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 的存在狀態(tài)，有研究表明盡管慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中HBV DNA 為低濃度狀態(tài)，但體內(nèi)cccDNA 仍復(fù)制活躍，且其肝臟組織學(xué)證據(jù)仍提示有炎癥及纖維化傾向［5］。監(jiān)測(cè)肝組織內(nèi)cccDNA 需要進(jìn)行肝組織活檢，臨床上難以連續(xù)實(shí)施，肝組織內(nèi)cccDNA 分布不均以及松弛環(huán)狀雙鏈DNA（rcDNA）的存在也為其檢測(cè)增加了難度［6］。

2017年歐洲肝病研究協(xié)會(huì)（EASL）新發(fā)布的臨床實(shí)踐指南將血清HBV RNA 定義為一種新型的血清標(biāo)志物，并指出其主要成分前基因RNA（pgRNA）以病毒樣顆粒釋放入血［1］。pgRNA 為cccDNA 的直接轉(zhuǎn)錄體，能精確地反映肝細(xì)胞中cccDNA 的存在狀態(tài)，血清HBV RNA 的檢測(cè)將為CHB 患者體內(nèi)病毒復(fù)制狀態(tài)及其治療效能提供更為直接的證據(jù)［7］。為此，本研究探討當(dāng)CHB 患者血清HBV DNA 處于低復(fù)制水平時(shí)，血清HBV RNA 的存在狀態(tài)、影響因素，旨在為臨床診治CHB 提供新思路。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

血清乙型肝炎病毒（HBV）RNA 為一種新型的血清標(biāo)志物，其主要成分前基因RNA（pgRNA）為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的直接轉(zhuǎn)錄體，能精確地反應(yīng)肝細(xì)胞中cccDNA 的存在狀態(tài)。血清HBV RNA作為檢測(cè)HBV 感染的一項(xiàng)新的血清標(biāo)志物，其在不同乙肝e 抗原（HBeAg）狀態(tài)的患者中，與其他血清標(biāo)志物的相關(guān)性等問題研究較少，本文就這一問題進(jìn)行了探討，結(jié)果表明血清HBV RNA 在不同HBeAg 狀態(tài)的患者中存在較大差異，且與其他血清標(biāo)志物存在一定的相關(guān)性。下一步將深入分析不同藥物治療下血清HBV RNA 水平的動(dòng)態(tài)變化等問題。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》（以下簡(jiǎn)稱《防治指南》）［8］中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；明確HBV 感染至少6 個(gè)月；血清HBV DNA＜1.0×104U/ml。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他嗜肝病毒感染；酒精性肝病；非酒精性脂肪性肝病；藥物性肝病；代謝性肝病及自身免疫性肝病，或其他原因所導(dǎo)致的肝損傷；HIV 感染者；原發(fā)性膽汁性肝硬化患者［8］。

1.2 研究對(duì)象 回顧性選取2018年5—7月于湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院湖南省人民醫(yī)院確診且符合研究標(biāo)準(zhǔn)的CHB 患者。患者均處于HBV DNA 低水平狀態(tài)，入院后均按照《防治指南》［8］進(jìn)行治療。本研究患者均對(duì)本研究知情同意。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 采集患者清晨空腹靜脈血 5 ml，加入抗凝管中，4000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm）后收集上清液，分裝于1.5 ml 無酶EP 管中，置于-80 ℃保存待檢。

1.3.2 HBV 血清標(biāo)志物（HBV-M）檢測(cè) 采用北京萬泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Caris200，試劑為購于廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司的乙型肝炎診斷試劑盒，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，其中乙肝表面抗原定量（qHBsAg）檢測(cè)有效范圍為0.05～250.00 U/ml，乙肝e 抗原（HBeAg）為定性檢測(cè)。

1.3.3 肝功能指標(biāo)的檢測(cè) 采用貝克曼5800 全自動(dòng)生化分析儀，試劑購自上海科華生物工程股份有限公司。以血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）作為觀察指標(biāo)，二者均應(yīng)用雙試劑速率法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 血清HBV DNA 檢測(cè) 采用上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的 SLAN Real-Time PCR Detection System 96熒光定量檢測(cè)儀，試劑購自湖南圣湘生物科技股份有限公司，應(yīng)用qPCR 法，由獲得PCR 上崗證工作人員嚴(yán)格按說明書操作進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒檢測(cè)下限為1.0×102U/ml。

1.3.5 血清HBV RNA 的檢測(cè) 采用上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的SLAN Real-Time PCR Detection System 96 熒光定量檢測(cè)儀，試劑購自湖南圣湘生物科技股份有限公司，應(yīng)用RT-qPCR 法，由獲得PCR 上崗證工作人員嚴(yán)格按說明書操作進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒的檢測(cè)下限為0.5×102U/ml。

1.4 觀察指標(biāo) 依據(jù)患者HBeAg 情況將患者分為HBeAg 陽性患者和HBeAg 陰性患者，比較其年齡、性別、血清ALT 水平、血清AST 水平、血清qHBsAg 水平、血清HBV DNA 水平、血清HBV RNA 水平、血清HBV RNA 水平低于檢測(cè)下限發(fā)生率，分析CHB 患者血清HBV RNA 水平及其低于檢測(cè)下限的影響因素，以及血清HBV RNA 水平與ALT、AST、qHBsAg、HBeAg、HBV DNA 的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，GraphPad Prism 6.0 繪制統(tǒng)計(jì)圖。CHB 患者血清標(biāo)志物數(shù)據(jù)均進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（log）。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用線性回歸分析及多因素Logistic 回歸分析血清HBV RNA 水平及其低于檢測(cè)下限的影響因素。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB 患者臨床資料 本研究共納入HBV DNA 檢測(cè)處于低水平狀態(tài)的CHB 患者72 例，平均年齡為（49.5±13.5）歲；男46 例，女26 例；HBeAg 陽性12 例，HBeAg 陰性60 例。HBeAg 陽性與HBeAg 陰性患者性別、血清ALT 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HBeAg 陽性患者年齡小于HBeAg 陰性患者，血清AST、qHBsHg、HBV RNA 水平高于HBeAg 陰性患者，血清HBV DNA 水平、血清HBV RNA 水平低于檢測(cè)下限發(fā)生率低于HBeAg 陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素分析 分別以年齡（賦值：連續(xù)性變量）、性別（賦值：男=1，女=2）、ALT（賦值：連續(xù)性變量）、AST（賦值：連續(xù)性變量）、qHBsAg（賦值：連續(xù)性變量）、HBeAg（賦值：HBeAg 陰性=0，HBeAg 陽性=1）、HBV DNA（賦值：連續(xù)性變量）為自變量，以血清HBV RNA 為因變量（賦值：連續(xù)性變量）進(jìn)行單因素線性回歸分析，結(jié)果顯示，年齡、qHBsAg、HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素（P＜0.05）。將單因素分析中P＜0.200 的自變量納入多因素線性回歸分析，結(jié)果顯示，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素（P＜0.05，見表2）。

表2 CHB 患者血清HBV RNA 水平影響因素的單因素和多因素線性回歸分析Table 2 Univariate and multivariate linear regression analysis of factors influencing serum HBV RNA levels in CHB patients

表1 HBeAg 陽性與HBeAg 陰性患者臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between HBeAg positive and HBeAg negative patients

2.3 CHB 患者血清HBV RNA 水平低于檢測(cè)下限的影響因素分析 以年齡（賦值：連續(xù)性變量）、性別（賦值：男=1，女=2）、ALT（賦值：連續(xù)性變量）、AST（賦值：連續(xù)性變量）、qHBsHg（賦值：連續(xù)性變量）、HBeAg（賦值：HBeAg 陰性=0，HBeAg 陽性=1）、HBV DNA（賦值：連續(xù)性變量）為自變量，以CHB 患者血清HBV RNA 是否低于檢測(cè)下限（賦值：是=1，否=0）為因變量，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，qHBsAg〔OR=1.682，95%CI（1.055，2.681），P=0.029〕、HBeAg〔OR=3.85，95%CI（1.068，13.880），P=0.039〕是CHB 患者血清HBV RNA 水平低于檢測(cè)下限的影響因素。

2.4 CHB 患者血清HBV RNA 水平與ALT、AST、qHBsAg、HBeAg、HBV DNA 的相關(guān)性分析 CHB 患者血清中ALT 為1.44（1.21，1.74）U/L，AST 為1.43（1.29，1.68）U/L，qHBsAg 為2.87（1.34，3.33）U/ml，HBV DNA 為2.85（2.39，3.19）U/ml，HBV RNA 為1.70（1.70，1.95）U/ml。CHB 患者血清HBV RNA 水平與qHBsAg（rs=0.322，P=0.006）、HBeAg（rs=0.235，P=0.047）相關(guān)，與ALT（rs=0.038，P=0.752）、AST（rs=0.189，P=0.557）、HBV DNA（rs=0.058，P=0.629）水平均無相關(guān)關(guān)系。

在HBeAg 陽性患者中，血清HBV RNA 水平與qHBsAg（rs=0.848，P＜0.001）、HBeAg（rs=0.725，P=0.008）相關(guān)，與ALT（rs=0.051，P=0.876）、AST（rs=0.046，P=0.702）、HBV DNA（rs=0.383，P=0.219）無相關(guān)關(guān)系。在HBeAg 陰性患者中，血清HBV RNA 水平與ALT（rs=-0.020，P=0.878）、AST（rs=-0.080，P=0.542）、qHBsAg（rs=0.151，P=0.251）、HBeAg（rs=0.083，P=0.529）、HBV DNA（rs=0.145，P=0.268）均無相關(guān)關(guān)系。

3 討論

目前CHB 患者的治療仍面臨著停藥難、易反彈等難題，現(xiàn)有的血清標(biāo)志物難以準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 的存在狀態(tài)［9］。1996年德國學(xué)者KOCK 等在研究HBV 是否能感染人外周單個(gè)核細(xì)胞時(shí)在CHB 患者血清中檢測(cè)到了HBV RNA［10］。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于血清HBV RNA 進(jìn)行了廣泛研究，不斷改進(jìn)和優(yōu)化其檢測(cè)方式，同時(shí)對(duì)其臨床意義進(jìn)行了深入探 索［7，9，11-12］。

《防治指南》［8］提出CHB 患者治療的理想終點(diǎn)是HBeAg 陽性和HBeAg 陰性的患者停藥之后實(shí)現(xiàn)持久的HBsAg 清除，伴或不伴HBsAg 的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。然而HBsAg 并不能完全代表肝細(xì)胞內(nèi)HBV 的復(fù)制情況，在實(shí)際治療過程中HBsAg 轉(zhuǎn)陰率并不理想。本研究比較了當(dāng)HBV DNA 低水平狀態(tài)時(shí)，在HBeAg 陽性和 HBeAg 陰性的CHB 患者血清HBV RNA 水平，并發(fā)現(xiàn)二者血清HBV RNA 水平差異顯著。本研究結(jié)果顯示，HBeAg 陽性患者年齡小于HBeAg 陰性患者，與楊建功等［13］得出的HBeAg 陰性發(fā)生率與年齡有關(guān)的結(jié)果相似。進(jìn)一步進(jìn)行影響因素分析結(jié)果顯示，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素。相關(guān)性分析顯示，CHB 患者血清HBV RNA 水平與HBeAg 相關(guān)；且在HBeAg 陽性患者中，血清HBV RNA 水平與HBeAg 相關(guān)，表明血清HBV RNA 水平能較準(zhǔn)確反應(yīng)CHB 患者體內(nèi)病毒的復(fù)制狀態(tài)。HUANG 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用核苷及核苷酸類藥物（NAs）治療過程中，血清HBV RNA 水平或可作為預(yù)測(cè)HBeAg 發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的血清標(biāo)志物［15］。

雖然從一定程度上來說，HBV DNA 也能反映體內(nèi)cccDNA 的復(fù)制活性，且HBV RNA 的低檢出率是與此現(xiàn)象一致的，然而，HBV DNA 低于檢測(cè)下限僅表明該病毒的反轉(zhuǎn)錄過程被抑制，并不能反映cccDNA 的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，在反轉(zhuǎn)錄過程被抑制后，cccDNA 仍以HBV RNA 病毒樣顆粒的形式產(chǎn)生子代病毒，因此以現(xiàn)有病毒學(xué)應(yīng)答為前提條件停藥后，疾病反彈和復(fù)發(fā)率較高［5，16-18］。 本研究結(jié)果顯示，CHB 患者血清HBV DNA 水平與血清HBV RNA 水平無相關(guān)關(guān)系，且在不同HBeAg 狀態(tài)的患者中，其血清HBV DNA 水平與血清HBV RNA 水平也無直線相關(guān)關(guān)系。這表明盡管HBV DNA 處于低水平或低于檢測(cè)下限的狀態(tài)，cccDNA 仍存在復(fù)制活性，導(dǎo)致HBV RNA 被檢出或處于較高水平。因此，HBV RNA 相較于HBV DNA 更能精確反應(yīng)cccDNA 的存在狀態(tài)，能為CHB 患者抗病毒治療效果提供更有力的證 據(jù)［5，19-20］。

HBeAg 陰性患者血清HBV RNA 水平低于檢測(cè)下限的發(fā)生率高于HBeAg 陽性患者，可能是HBeAg 陽性患者體內(nèi)cccDNA 轉(zhuǎn)錄活性相較于HBeAg 陰性患者活躍所導(dǎo)致，與其他學(xué)者的相關(guān)研究結(jié)論一致［21］。多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，qHBsAg 和HBeAg 是CHB患者血清HBV RNA 水平低于檢測(cè)下限的影響因素。本研究中CHB 患者血清HBV RNA 水平高于檢測(cè)下限的總檢出率為32%（23/72），與HUANG 等［18］研究中的檢出率相近，而LI 等［22］研究中的檢出率卻高達(dá)85.3%，該差異可能來源于樣本選取、人口學(xué)特征以及方法學(xué)等方面。

本研究結(jié)果顯示，HBeAg 陽性患者血清HBV RNA水平與HBeAg 相關(guān)，而在HBeAg 陰性患者中二者并無相關(guān)關(guān)系，這可能是由于HBeAg 不僅來自cccDNA，還可由整合的HBV 基因片段合成。研究表明，在HBV 感染的患者中，攜帶HBV DNA 整合片段的肝細(xì)胞大約占總肝細(xì)胞的1%，HBV DNA 整合后轉(zhuǎn)錄翻譯出HBeAg，這可能是臨床上導(dǎo)致其無法徹底清除的重要原因［23-24］。因此，HBeAg 對(duì)于評(píng)判患者是否達(dá)到臨床治愈水平有一定缺陷，而血清HBV RNA 為cccDNA 的直接轉(zhuǎn)錄體，相較于HBeAg 更能直接反應(yīng)目前體內(nèi)cccDNA 的復(fù)制活性。有學(xué)者建議將HBV RNA 納入臨床診斷、疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)和抗病毒藥物合理化停藥的應(yīng)用中［25-27］。然而，其作為一項(xiàng)成熟的血清標(biāo)志物運(yùn)用于臨床還需要準(zhǔn)確性、靈敏度更高，更加標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法以及進(jìn)行更完善的前瞻性研究。

綜上所述，不同HBeAg 情況的低水平HBV DNA CHB 患者血清HBV RNA 水平存在較大差異，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素，HBeAg、qHBsAg 是CHB 患者HBV RNA 低于檢測(cè)下限的影響因素。同時(shí)CHB 患者血清HBV RNA 水平與其他血清標(biāo)志物存在一定的相關(guān)性。因此說明，低水平HBV DNA CHB 患者血清HBV RNA 水平一定程度上可反應(yīng)CHB患者體內(nèi)病毒的活躍狀態(tài)，可作為檢測(cè)HBV 感染的一項(xiàng)新的血清標(biāo)志物。