普羅布考對腎小管上皮細胞氧糖剝奪/復氧損傷的影響及其機制研究

任廣偉，龔淼，李明明，牛哲莉，楊洪娟，孫利軍*

氧糖剝奪/復氧（OGD/R）細胞模型多被用于在細胞水平上模擬急性缺血-再灌注（I/R）損傷的過程，應用此模型可進行藥物保護作用與機制的研究和治療靶向的探討［1］。腎I/R 是導致急性腎損傷的常見原因［2］，研究發現，腎I/R 損傷引起腎小管上皮細胞死亡的主要方式是壞死與鐵死亡，其主要機制是細胞脂質過氧化［3-5］。普羅布考是具有很強抗氧化作用的降血脂藥［6］，多項研究表明，普羅布考可以通過提高細胞內抗氧化酶活性降低脂質過氧化水平，具有較好的組織或細胞保護作用［7］。目前，尚未見到關于普羅布考對OGD/R 引起的人腎小管上皮細胞株（HK-2）損傷影響的報道。為此，本研究通過建立HK-2 的OGD/R 模型模擬腎小管上皮細胞的I/R 損傷，研究普羅布考對HK-2 損傷的保護作用及機制，以期為尋找新的治療方向提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2017年12月—2018年9月。

1.2 細胞株與主要試劑 HK-2（中國科學院上海生科院細胞資源中心），普羅布考、凋亡抑制劑（Z-VADFMK）、鐵死亡抑制劑（Fer-1）、壞死性凋亡抑制劑、自噬抑制劑（3-methyladenine）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性檢測試劑盒（Sigma 公司），兔抗GPX4 單克隆抗體（sc-166120）、兔抗β-actin 單克隆抗體（sc-58673）（Santa Cruz 公司），噻唑藍（MTT）細胞增殖活性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測分析試劑盒和ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.3 OGD/R 模型的建立方法 參照WEI 等［1］的方法常規培養HK-2 至完全貼壁，用缺血模擬溶液（包括5.37 mmol/L KCl、136.89 mmol/L NaCl、0.44 mmol/L KH2PO4、0.338 mmol/L Na2HPO4、4.166 mmol/L NaHCO3和5 mmol/L D-葡萄糖，pH 值為6.8）代替常規培養液培養細胞，將細胞放入含5% CO2和95% N2的密閉容器，將密閉容器放入缺氧培養箱（5% CO2、1% O2和94% N2）于37 ℃培養2 h 模擬缺血缺氧條件，2 h 后用常規培養液替換缺血模擬溶液在37 ℃、5% CO2正常條件下培養3 h 模擬復氧過程。

1.4 預實驗確定普羅布考最佳作用時間與濃度 取HK-2，胰酶消化后制成細胞懸液，調整細胞濃度達6×105/L，將細胞接種到96 孔板，每孔加入細胞懸液100 μl，待細胞完全貼壁后將其分為正常對照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組。正常對照組不予處理，OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組進行OGD/R 模型的建立，之后OGD/R 組不予處理，OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組分別加入25、50、100 μmol/L 普羅布考。分別于12、24、48 h 時，采用噻唑藍（MTT）細胞增殖活性檢測試劑盒，每組設6 個復孔，利用酶標儀在570 nm 波長處測量各組吸光度值（A 值），計算細胞增殖活性〔細胞增殖活性（%）=實驗組A 值/對照組A 值×100%〕，確定普羅布考最佳作用時間與濃度，用于后續實驗。

本研究價值：

腎缺血-再灌注（I/R）損傷的主要病理生理基礎是腎小管上皮細胞發生脂質過氧化損傷，而腎小管上皮細胞損傷直接影響尿液的形成。普羅布考曾經是臨床上常用藥，逐漸被新藥所取代。本研究首次將普羅布考應用于腎小管上皮細胞急性I/R 模型的處理，觀察普羅布考的作用靶點，不僅為腎I/R 損傷的治療提供實驗依據，也為其他器官的I/R 損傷治療提供新思路。

1.5 正式實驗分組 取HK-2，胰酶消化后制成細胞懸液，調整細胞濃度達3×105/L，將細胞接種到96 孔板，每孔加入細胞懸液200 μl，待細胞完全貼壁后將其分為正常對照組（不予處理）、OGD/R 組（建立OGD/R模型）、普羅布考組（給予最佳作用濃度的普羅布考）、OGD/R+普羅布考組（建立OGD/R 模型后給予最佳作用濃度的普羅布考）。

1.6 觀察細胞形態 于普羅布考最佳作用時間，采用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態并拍照。

1.7 LDH 釋放法檢測LDH 活性 于普羅布考最佳作用時間，取出培養板400 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），將各孔內上清液吸干凈，加入150 μl 用PBS稀釋10 倍的LDH 釋放工作液，輕搖混勻，放入培養箱培養1 h 后取出，400 r/min 離心5 min（離心半徑 15 cm），每孔取上清液120 μl 加入新的96 孔板，每孔加入60 μl LDH 檢測工作液，輕搖混勻，室溫避光孵育30 min，每組設6 個復孔，在490 nm 波長處測定各孔吸光度。檢測的吸光度越大說明LDH 活性越強，故用吸光度表示LDH 活性。

1.8 MDA 試劑盒檢測MDA 水平和酶促法檢測GPX 活性 于普羅布考最佳作用時間，取各組細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，放入不同離心管內冰上裂解細胞，裂解完成后將各組離心管放入低溫離心機4 ℃ 1000 r/min離心20 min（離心半徑15 cm），取各組上清液作為檢測用細胞蛋白勻漿，一部分上清液嚴格按照MDA 試劑盒說明步驟進行MDA 水平檢測，重復檢測6 次；另一部分上清液放入96 孔板內，依次加入檢測緩沖液和檢測工作液，輕搖混勻后每孔加入5 μl 有機過氧化物試劑（t-Bu-OOH）溶液進行反應，每組設6 個復孔，立即在340 nm 波長處用酶標儀檢測吸光度，隨后室溫下繼續反應5 min，再次在340 nm 波長處上機檢測吸光度，即GPX 活性。

1.9 生化法檢測GSH 水平 于普羅布考最佳作用時間，用細胞刮收集各組細胞移入離心管中，1200 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），離心2 次，去除上清液，向離心管內加入蛋白去除試劑溶液，1000 r/min 離心 5 min（離心半徑15 cm），取上清液分別加入96 孔板，每組設6 個復孔，依次加入檢測工作液，在410 nm 波長處用酶標儀檢測各孔吸光度，即GSH 水平。

1.10 Western blotting 法檢測GPX4 水平 于普羅布考最佳作用時間，取各組細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，冰上裂解提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白上樣量調整為50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉膜，加入3%牛血清清蛋白（BSA）室溫封閉2 h，去除封閉液后分別加入Tris-HCl 緩沖液（TBS）稀釋的GPX4（1∶200）、β-actin（1∶500）抗體，4 ℃孵育12 h，加入辣根酶過氧化物標記的羊抗小鼠IgG（1∶200），室溫孵育1 h，應用ECL 化學發光試劑盒顯色并顯影。應用Quantity One 軟件對條帶進行定量分析，以GPX4/β-actin 表示GPX4 水平。

1.11 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預實驗結果 正常對照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組12、24、48 h 時細胞增殖活性比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組12、24、48 h 時細胞增殖活性低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時細胞增殖活性高于OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組，差異有統計學意義（P＜0.05）。OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時細胞增殖活性高于本組12 h 時，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。由于用藥原則為在相似的作用下，一般選擇較低濃度及較短作用時間，因此采用50 μmol/L 普羅布考作用24 h 進行后續實驗。

2.2 細胞形態 正常對照組細胞呈三角形或多邊形，形態規則，細胞折光性良好，貼壁完全；OGD/R 組懸浮細胞增多，細胞皺縮體積減小，失去正常形態，折光性減弱；普羅布考組細胞形態結構正常，貼壁完整；OGD/R+普羅布考組懸浮細胞減少，細胞折光性較好（見圖1）。

2.3 LDH 活性 正常對照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R 組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH活性低于OGD/R組，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R+普羅布考組LDH 活性高于普羅布考組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 MDA 水平、GPX 活性 正常對照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組MDA 水平、GPX 活性比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R 組、OGD/R+普羅布考組MDA 水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組MDA 水平低于OGD/R 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R+ 普羅布考組MDA 水平高于普羅布考組，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R組GPX 活性低于正常對照組，差異有統計學意義 （P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX活性高于OGD/R 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R+普羅布考組GPX 活性低于普羅布考組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.5 GSH 水平 正常對照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GSH 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R 組GSH 水平低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GSH 水平高于OGD/R 組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表1 正常對照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組不同時間細胞增殖活性比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of cell proliferation in normal control group，OGD/R group，OGD/R+25 μmol/L probucol group，OGD/R+50 μmol/L probucol group and OGD/R+100 μmol/L probucol group at different time points of intervention

表1 正常對照組、OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組不同時間細胞增殖活性比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of cell proliferation in normal control group，OGD/R group，OGD/R+25 μmol/L probucol group，OGD/R+50 μmol/L probucol group and OGD/R+100 μmol/L probucol group at different time points of intervention

注：OGD/R=氧糖剝奪/復氧；與正常對照組比較，aP＜0.05；與OGD/R 組比較，bP＜0.05；與OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組比較，cP＜0.05；與本組12 h 比較，dP＜0.05

組別12 h24 h48 h正常對照組100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00 OGD/R 組50.23±1.52a51.68±1.26a49.28±1.39a OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組50.77±1.97a52.09±1.48a53.43±2.11a OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組53.52±1.83a 64.97±1.92abcd 67.89±1.68abcd OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組56.65±1.75a 65.31±1.54abcd 69.47±1.35abcd F 值59.02545.71436.245 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2.6 GPX4 水平 正常對照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX4 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；OGD/R 組GPX4 水平低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX4 水平高于OGD/R 組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2、圖2）。

圖2 Western blotting 法檢測GPX4 水平的SDS-PAGE 圖Figure 2 SDS-PAGE picture of GPX4 level detected by Western blotting

表2 正常對照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平、GPX 活性、GSH 水平、GPX4 水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of LDH activity，MDA level，GPX activity，GSH level and GPX4 level in normal control group，OGD/R group，probucol group and OGD/R+probucol group

表2 正常對照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平、GPX 活性、GSH 水平、GPX4 水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of LDH activity，MDA level，GPX activity，GSH level and GPX4 level in normal control group，OGD/R group，probucol group and OGD/R+probucol group

注：LDH=乳酸脫氫酶，MDA=丙二醛，GPX=谷胱甘肽過氧化物酶，GSH=谷胱甘肽；與正常對照組比較，aP＜0.05；與OGD/R 組比較，bP＜0.05；與普羅布考組比較，cP＜0.05

組別LDH 活性（U/L）MDA（nmol/mg）GPX 活性（U/mg）GSH（mg/g）GPX4正常對照組97.65±9.432.33±0.02197.48±11.3225.17±0.020.53±0.01 OGD/R 組659.21±27.02a27.53±0.05a104.72±13.25a9.76±0.01a0.28±0.01a普羅布考組76.63±10.27b1.79±0.01b213.29±12.56b27.41±0.02b0.58±0.01b OGD/R+普羅布考組487.63±32.58abc12.31±0.02abc186.37±10.71bc26.59±0.02b0.54±0.02b F 值26.30732.85531.28340.05217.569 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖1 正常對照組、OGD/R 組、普羅布考組、OGD/R+普羅布考組細胞形態（×100）Figure 1 Cell morphology in normal control group，OGD/R group，probucol group and OGD/R+probucol group

3 討論

臨床上，腎I/R 損傷通過引起急性腎小管壞死導致急性腎衰竭，目前尚無有效治療方法。已有研究證實，缺血后處理對腎I/R 損傷發揮一定保護作用［8］，其可通過調節細胞凋亡信號途徑中的某些相關蛋白抑制腎小管上皮細胞凋亡進而減輕腎臟損傷［9］。腎I/R 引起的正常腎小管上皮細胞的形態學改變除了細胞凋亡與壞死，還包括細胞鐵死亡［10-12］。減輕腎I/R 損傷的治療靶點主要包括對腎小管上皮細胞的保護和損傷改善作用。普羅布考最初的臨床應用是作為降脂藥物，越來越多的研究發現普羅布考還具有強抗氧化、抗炎與抗腫瘤活性，使其在臨床上作為強抗氧化劑應用于防治心血管疾病［13］。因此，本研究將HK-2 細胞株作為研究對象，應用國際公認的OGD/R 細胞模型，探討普羅布考對腎小管上皮細胞OGD/R 模型的作用及其可能機制。

本研究結果顯示，正常對照組細胞呈三角形或多邊形，形態規則，細胞折光性良好，貼壁完全；OGD/R組懸浮細胞增多，細胞皺縮體積減小，失去正常形態，折光性減弱；普羅布考組細胞形態結構正常，貼壁完整；OGD/R+普羅布考組懸浮細胞減少，細胞折光性較好；OGD/R 組12、24、48 h 時細胞增殖活性低于正常對照組。以上結果表明模型建立成功。OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組12、24、48 h 時細胞增殖活性低于正常對照組，OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時細胞增殖活性高于OGD/R 組、OGD/R+25 μmol/L 普羅布考組，OGD/R+50 μmol/L 普羅布考組、OGD/R+100 μmol/L 普羅布考組24、48 h 時細胞增殖活性高于本組12 h 時，說明細胞增殖活性對普羅布考具有劑量和時間依賴性，提示普羅布考可能對腎小管上皮細胞的損傷具有保護作用。OGD/R 組LDH 活性、MDA 水平高于正常對照組，表明OGD/R 引起HK-2 細胞發生脂質過氧化及LDH 活性升高，可能原因是腎臟急性缺血缺氧可引起活性氧簇（ROS）大量產生，超過細胞生物行為的需要，過量的ROS 作用于脂肪酸可以造成脂質過氧化，而脂質過氧化物可以改變細胞膜的通透性和流動性，引起細胞膜結構的破壞，導致LDH 的釋放和活性增高。OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平高于正常對照組、普羅布考組，普羅布考組、OGD/R+普羅布考組LDH 活性、MDA 水平低于OGD/R 組，而OGD/R 組GSH 水平低于正常對照組，普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GSH 水平高于OGD/R 組，提示普羅布考可能通過激活細胞內的抗氧化酶類降低細胞的脂質過氧化水平，進而降低脂質過氧化水平抑制LDH 的活性。OGD/R 組GPX 活性、GPX4 水平低于正常對照組，提示OGD/R 引起GPX4 活性降低，導致腎小管上皮細胞損傷加重；普羅布考組、OGD/R+普羅布考組GPX 活性、GPX4 水平高于OGD/R組，提示普羅布考可能直接或通過提高GPX 活性間接抑制脂質過氧化物的產生，發揮細胞保護作用。本結果與SANTOS 等［14］的研究結果一致，該研究指出普羅布考的抗氧化作用主要包括兩方面：一是直接清除細胞內和細胞膜上的氧自由基，抑制脂質過氧化物的產生；二是直接或間接提高內源性抗氧化劑的儲備或激活細胞內抗氧化酶系，發揮清除脂質過氧化物的作用，其中包括對GPX 的激活。

本研究結果還顯示，普羅布考在處理細胞12 h 以內并未發現明顯的保護作用，24 h 以后才逐漸提高細胞增殖活性，并呈時間依賴性，這一結果與普羅布考代謝緩慢的藥理學特性一致，本研究結果與WANG 等［15］的結果一致，該研究表明普羅布考的t1/2長，其藥理作用在停藥后仍可維持數月，因此，在臨床應用中普羅布考可作為預防用藥。

由于腎I/R 引起的腎小管上皮細胞死亡是一個多因素作用的病理生理過程，普羅布考對腎小管上皮細胞的保護作用可能不僅限于抑制脂質過氧化，還有其他靶點和途徑，本研究具有一定局限性。在今后的研究中，本研究將進一步探討普羅布考對模型細胞死亡途徑的影響，以期為腎小管上皮細胞I/R 損傷尋找更多的治療 靶點。

綜上所述，普羅布考對OGD/R 引起的HK-2 損傷具有保護作用，可能的機制是通過激活GPX，尤其是提高GPX4 水平，直接或間接抑制脂質過氧化物的過度產生。本研究不僅為普羅布考老藥新用提供了實驗依據，還為GPX4 作為腎小管上皮細胞I/R 損傷的治療靶點提供了理論基礎。