數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)及其在感染性疾病中的應(yīng)用

趙云，王蕾，郭雅萌，陳力，湯慧

1. 重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 405200； 2. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 教育部感染性疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科，重慶 400010

準(zhǔn)確、靈敏且具有重復(fù)性的核酸檢測(cè)方法對(duì)準(zhǔn)確獲知并描述靶標(biāo)核酸分子在生物學(xué)過(guò)程中的作用和動(dòng)力學(xué)具有重要意義。自誕生以來(lái)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及其衍生技術(shù)在推動(dòng)現(xiàn)代分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)的研究和應(yīng)用發(fā)展中起到了基礎(chǔ)性作用。特別是實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative PCR，qPCR)技術(shù)，已成為核酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于科研和臨床診斷各領(lǐng)域。

然而，qPCR應(yīng)用的深入和拓展受其固有方法學(xué)局限的制約。作為核酸間接定量手段， qPCR難以穩(wěn)定、可靠地檢測(cè)高豐度同源序列背景下的極低豐度靶標(biāo)序列[1]，難以識(shí)別微小靶標(biāo)核酸濃度變化[2]，無(wú)法脫離標(biāo)準(zhǔn)曲線等外部參照進(jìn)行定量[3]，難以保證數(shù)據(jù)的精密度，特別是在靶標(biāo)核酸含量較低時(shí)[4]。

1992年，Morley等提出了不同于qPCR的“有限稀釋PCR”(limiting dilution PCR)，用于定量檢測(cè)IgH基因重排，可在 160 000 拷貝野生型背景中檢測(cè)出2拷貝的突變序列[5]。隨后，他們于TheLancet報(bào)道了使用有限稀釋PCR高靈敏度定量檢測(cè)白血病細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和分析急性白血病的預(yù)后[6]。1999年，Vogelstein和Kinzler[7]第1次使用“數(shù)字PCR”(digital PCR，dPCR)來(lái)命名基于有限稀釋PCR的方法，并成功在結(jié)直腸癌患者糞便DNA樣本中對(duì)KRAS突變進(jìn)行了定量分析。

1 dPCR的原理和特性

1.1 dPCR 的基本原理

現(xiàn)代dPCR依然遵從“有限稀釋PCR”的基本原理，通過(guò)特定的技術(shù)手段，將原本是一個(gè)整體的熒光PCR反應(yīng)體系(例如20 μL)隨機(jī)“分裝/分配”(partitioning)至大量(通常是數(shù)萬(wàn)個(gè))等體積微小獨(dú)立PCR反應(yīng)單元中(納升級(jí)甚至更小的體積)，使一部分微反應(yīng)單元中不含有靶標(biāo)核酸分子，而其他微反應(yīng)單元中含有1拷貝至多個(gè)拷貝的靶標(biāo)核酸分子[4,8-9]。在隨后的PCR步驟中，各微反應(yīng)單元擴(kuò)增至終點(diǎn)，未含靶標(biāo)序列的微反應(yīng)單元保持背景熒光強(qiáng)度，含有靶標(biāo)序列的微反應(yīng)單元的熒光信號(hào)顯著提升，從而可將各微反應(yīng)單元?jiǎng)澐譃殛幮曰蜿?yáng)性反應(yīng)(圖 1)。

圖1 數(shù)字PCR的原理和工作流程

Fig.1 The principle and workflow of digital PCR

泊松分布概率函數(shù)的引入拓展了dPCR的動(dòng)態(tài)范圍。陽(yáng)性微反應(yīng)單元中可能含有多于1拷貝的靶標(biāo)分子(特別是在樣本濃度較高時(shí))，故陽(yáng)性微反應(yīng)單元的數(shù)量并不能直接代表靶標(biāo)分子的數(shù)量，且陽(yáng)性微反應(yīng)單元或陰性微反應(yīng)單元出現(xiàn)的概率遵從泊松分布概率函數(shù)[4,10]。因此，只要獲得陽(yáng)性微反應(yīng)單元或陰性微反應(yīng)單元在總反應(yīng)單元中的比例，即可根據(jù)泊松分布函數(shù)計(jì)算出樣本的拷貝數(shù)濃度(拷貝/μL)。計(jì)算方式如下：

其中C為靶標(biāo)分子的拷貝數(shù)濃度；P為陽(yáng)性微反應(yīng)單元的比例；V為微反應(yīng)單元的反應(yīng)體積；A為總反應(yīng)體積；B為樣本載入體積。注意這個(gè)過(guò)程中沒(méi)有使用任何外部參照，如標(biāo)準(zhǔn)曲線。dPCR將熒光PCR擴(kuò)增過(guò)程中與PCR產(chǎn)物積累相關(guān)的呈指數(shù)增長(zhǎng)的熒光模擬信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性數(shù)字化信號(hào)，基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析直接獲取靶標(biāo)分子的初始含量。

根據(jù)隨機(jī)分裝的方式及微反應(yīng)單元性質(zhì)的不同，目前dPCR可分為芯片式數(shù)字PCR(chip-based digital PCR，cdPCR)和微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)兩大類(lèi)。前者是在硅芯片上通過(guò)蝕刻技術(shù)制作出數(shù)萬(wàn)個(gè)彼此獨(dú)立的反應(yīng)孔組成的矩陣；后者是通過(guò)數(shù)萬(wàn)至千萬(wàn)個(gè)均勻的油包水(water in oil，W/O)微液滴作為微反應(yīng)單元。由于技術(shù)手段不同，兩種數(shù)字PCR系統(tǒng)各有特點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，ddPCR設(shè)計(jì)較為靈活，作為微反應(yīng)單元的油包水微滴數(shù)的增加容易實(shí)現(xiàn)，也更易實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化，運(yùn)行成本更低。由于微滴的可操控性，ddPCR的應(yīng)用范圍可進(jìn)一步深入拓展。

1.2 dPCR的特性與優(yōu)勢(shì)

dPCR作為一種“分子計(jì)數(shù)”的方法，有著獨(dú)特的方法學(xué)特性。首先，dPCR的線性范圍與微反應(yīng)單元的數(shù)量有關(guān)，反應(yīng)單元數(shù)越多，線性范圍越寬。例如，2萬(wàn)個(gè)微液滴的ddPCR平臺(tái)可覆蓋5個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍，陽(yáng)性微滴的比例在 0.16%～99.6% 的區(qū)間[9]，對(duì)應(yīng)1～100 000 拷貝范圍。樣本濃度超過(guò)dPCR的線性動(dòng)態(tài)范圍會(huì)導(dǎo)致微反應(yīng)單元呈飽和陽(yáng)性狀態(tài)，無(wú)法進(jìn)行定量。其次，dPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)的精密度在平均每個(gè)微反應(yīng)單元含有約 1.59 拷貝時(shí)最高，與微反應(yīng)單元數(shù)量無(wú)關(guān)。此外，微反應(yīng)單元體積的均一性對(duì)確保dPCR定量的準(zhǔn)確性來(lái)說(shuō)非常重要[10]。最后，基于泊松分布函數(shù)的特性，從單個(gè)反應(yīng)的dPCR結(jié)果即可估計(jì)出泊松誤差范圍。

目前qPCR依然是包括感染性疾病在內(nèi)的疾病相關(guān)核酸標(biāo)記檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其dPCR與qPCR相比在諸多方面有明顯優(yōu)勢(shì)(表1)。

表1 qPCR與dPCR的對(duì)比

Tab.1 The comparison of dPCR with qPCR

qPCRdPCR定量方式相對(duì)定量絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴(lài)無(wú)須檢測(cè)方式實(shí)時(shí)熒光信號(hào)檢測(cè),有Cq值PCR終點(diǎn)熒光信號(hào)檢測(cè),無(wú)Cq值受PCR擴(kuò)增效率變化的影響大小動(dòng)態(tài)范圍9～10個(gè)數(shù)量級(jí)5～6個(gè)數(shù)量級(jí)靈敏度*****精確度*****運(yùn)行成本***

1.2.1 絕對(duì)定量與qPCR依賴(lài)已知標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)定量分析不同，dPCR的絕對(duì)定量并不依賴(lài)任何外部參照，也不會(huì)受標(biāo)準(zhǔn)品的來(lái)源、儲(chǔ)運(yùn)、降解等影響而降低準(zhǔn)確性；dPCR提供的拷貝數(shù)濃度相比質(zhì)量濃度更能反映樣本中完整的可擴(kuò)增序列的有效含量。此外，定量檢測(cè)結(jié)果能為樣本陰陽(yáng)性判斷提供量化而客觀的、唯一固定的閾值。檢驗(yàn)人員可更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)卦诮o定的置信度內(nèi)，根據(jù)量化的指標(biāo)而無(wú)須依賴(lài)qPCR上無(wú)法唯一確定的Cq值來(lái)判斷靶標(biāo)分子的有無(wú)和確定樣本的狀態(tài)。

1.2.2 受PCR擴(kuò)增效率變化的影響較小由于采用PCR終點(diǎn)熒光分析的方式，dPCR并不關(guān)注擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)增長(zhǎng)速度，僅需測(cè)量各微反應(yīng)單元在PCR終點(diǎn)時(shí)的熒光信號(hào)，進(jìn)而分辨陽(yáng)性和陰性反應(yīng)并統(tǒng)計(jì)其數(shù)量。PCR擴(kuò)增效率的降低可能會(huì)影響各陽(yáng)性微反應(yīng)單元在PCR終點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，表現(xiàn)為熒光信號(hào)強(qiáng)度降低，但只要還能清晰地區(qū)分陽(yáng)性反應(yīng)單元簇與陰性反應(yīng)單元簇，即確定靶標(biāo)分子存在(1)或無(wú)(0)的狀態(tài)，仍可維持準(zhǔn)確定量。因此，dPCR受PCR擴(kuò)增效率變化的影響較qPCR小。

1.2.3 更高的靈敏度dPCR的高靈敏度尤其體現(xiàn)在高豐度野生型序列背景下對(duì)低豐度單堿基突變的檢測(cè)能力上。使用與qPCR相同的引物/探針時(shí)，dPCR能將對(duì)低豐度突變的檢測(cè)靈敏度提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。樣本的隨機(jī)分裝使得靶標(biāo)核酸和干擾檢測(cè)的背景序列都隨機(jī)進(jìn)入微反應(yīng)單元，在含有靶標(biāo)分子的反應(yīng)單元中減少了背景序列的豐度，相對(duì)提高了靶標(biāo)分子的含量，使靶標(biāo)分子的擴(kuò)增信號(hào)能更容易地被識(shí)別，進(jìn)而提高檢出率。例如，在腫瘤液體活檢中，ddPCR對(duì)各種酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感或耐藥的突變位點(diǎn)的檢測(cè)限可達(dá)到<0.01% 的水平[1]。在感染性疾病方面，ddPCR對(duì)病毒耐藥突變的檢測(cè)限能達(dá)到 0.1%，比臨床常規(guī)使用的qPCR提高50倍以上[11]。

此外，對(duì)于低濃度靶標(biāo)序列的定量，qPCR通常會(huì)由于擴(kuò)增不明顯或Cq值偏大(如>35)而不能有效檢測(cè)；但對(duì)于dPCR，靶標(biāo)序列在微小反應(yīng)單元中的擴(kuò)增會(huì)使該反應(yīng)單元熒光信號(hào)陡增，明顯區(qū)別于未擴(kuò)增的單元，能更容易地被檢測(cè)器識(shí)別出來(lái)。Persaud等報(bào)道，ddPCR能從106個(gè)人體免疫細(xì)胞中檢出<3拷貝的人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)[12]。

1.2.4 更高的精密度得益于“分子計(jì)數(shù)”的直接定量方式和終點(diǎn)分析，dPCR定量數(shù)據(jù)的精密度有很大提升，特別是對(duì)低濃度樣本的檢測(cè)，dPCR往往有更小的標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard derivation，SD)和變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。有報(bào)道稱(chēng)，對(duì)于微小RNA(micro RNA，miRNA)的定量檢測(cè)，相對(duì)于qPCR，ddPCR能將CV降低 37%～86%[4]。理論上，dPCR要實(shí)現(xiàn)在95%置信度下區(qū)分 1.1 倍的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)差異或基因表達(dá)差異，僅需 8 000 個(gè)左右的微反應(yīng)單元[2]，比qPCR更容易分辨靶標(biāo)分子的微小濃度變化，可用于CNV分析[2,13]、等位基因差異表達(dá)[14]及單細(xì)胞分析。

1.2.5 更好的重復(fù)性和再現(xiàn)性憑借不依賴(lài)外部參照可獨(dú)立獲得定量結(jié)果及更強(qiáng)的抗干擾能力，dPCR的檢查結(jié)果可在不同實(shí)驗(yàn)室間、不同批次間得到很好的重復(fù)和再現(xiàn)。2017年的一項(xiàng)針對(duì)ddPCR重復(fù)性和可操作性的室間評(píng)比研究表明，ddPCR在21個(gè)獨(dú)立的國(guó)際實(shí)驗(yàn)室之間針對(duì)低豐度(～0.17%)的KRAS G12D突變具有高度的檢測(cè)重復(fù)性[15]。

2 dPCR的發(fā)展歷程

盡管技術(shù)原理簡(jiǎn)單，但早期實(shí)現(xiàn)dPCR并不容易。在早期應(yīng)用中，Vogelstein和Kinzler等不得不使用384孔PCR反應(yīng)板，分析一個(gè)樣本需使用超過(guò)2 mL的反應(yīng)試劑[7]；且移液加樣操作煩瑣，實(shí)驗(yàn)效率低下。Perkel曾表示，通常很難說(shuō)服一名研究生使用dPCR開(kāi)展實(shí)驗(yàn)[16]。2006年，F(xiàn)luidigm公司推出了第1臺(tái)商業(yè)化的dPCR設(shè)備，這是基于集成流體回路(芯片)的dPCR系統(tǒng)，通過(guò)集成的腔室和閥門(mén)系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)樣本的分隔。2010年，Life Technologies公司收購(gòu)BioTrove公司，并推出了基于OpenArray 系統(tǒng)的dPCR平臺(tái)。2011年，Bio-Rad公司收購(gòu)QuantaLife公司，推出了成熟的ddPCR系統(tǒng)，并獲得廣泛應(yīng)用，發(fā)表了大量應(yīng)用文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)。

3 ddPCR在感染性疾病中的應(yīng)用

作為新一代核酸定量分析工具，dPCR的應(yīng)用涉及生命科學(xué)各方面，特別是在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中的應(yīng)用中不斷深入和拓展。在感染性疾病方面，最近幾年持續(xù)增長(zhǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道指出，ddPCR可用于多種病原微生物的臨床檢驗(yàn)和相關(guān)研究?；谄浼夹g(shù)特點(diǎn)，ddPCR不僅能對(duì)病原微生物的數(shù)量進(jìn)行定量檢測(cè)，還能檢測(cè)分析病原微生物耐藥突變、基因組多態(tài)性及用于單細(xì)胞捕獲分析等。

3.1 病原微生物的絕對(duì)定量

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)的標(biāo)定ddPCR不依賴(lài)外部參照即可精確定量的能力可用于標(biāo)準(zhǔn)參考物(standard reference material，SRM)的標(biāo)定。目前，dPCR潛在的計(jì)量學(xué)價(jià)值已在核酸SRM標(biāo)定方面獲得應(yīng)用[17-18]。美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)推出使用dPCR標(biāo)定的巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)SRM 2366[19]。這樣的SRM有助于建立qPCR方法質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)室間的量值溯源、方法學(xué)驗(yàn)證及不同檢測(cè)方法的比較。

3.1.2 病毒載量的監(jiān)測(cè)病毒載量的動(dòng)態(tài)變化具有顯著的臨床意義。ddPCR高靈敏度和高數(shù)據(jù)精密度的特性，有助于識(shí)別病毒載量的動(dòng)態(tài)變化，加深對(duì)一系列感染性疾病病原體的動(dòng)態(tài)和治療反應(yīng)的理解，如HIV感染、病毒性肝炎及結(jié)核病，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病進(jìn)展和療效的監(jiān)控。Strain等分別使用ddPCR和qPCR對(duì)150例HIV感染者樣本的總HIV DNA(pol基因拷貝/百萬(wàn)細(xì)胞)和染色體外2-LTR circle DNA進(jìn)行了分析，相比qPCR，ddPCR對(duì)這兩種靶標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的CV分別下降了5倍和20倍[20]。Taylor等[21]對(duì)1例流感病毒H1N1感染者在接受奧司他韋和扎那米韋(zanamivir)治療期間的鼻咽分泌物(nasopharyngeal aspirate，NPA)樣本分別用ddPCR和qPCR進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)qPCR數(shù)據(jù)的CV范圍為45%～109.7%，而ddPCR僅為 0.9%～11.4%。更重要的是，qPCR的定量結(jié)果沒(méi)有顯示出藥物治療與病毒載量的相關(guān)性，各檢測(cè)點(diǎn)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而ddPCR定量結(jié)果反映藥物治療過(guò)程中病毒載量顯著下降(P<0.05)。

3.1.3 克服抑制物的影響dPCR受PCR擴(kuò)增效率變化的影響較小，在應(yīng)用中對(duì)PCR抑制物的耐受程度更高，能在一定程度上克服臨床樣本中常見(jiàn)抑制物的不利影響[22]，從而有助于提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和陽(yáng)性檢出率。有報(bào)道證明，ddPCR可從各種復(fù)雜樣本中穩(wěn)定檢測(cè)靶標(biāo)核酸分子。Sedlak等使用多重ddPCR檢測(cè)糞便樣本中的CMV[23]，比qPCR有更好的表現(xiàn)。Cao等[24]使用雙重ddPCR定量檢測(cè)腸球菌屬和人類(lèi)糞便相關(guān)的HF183標(biāo)記以評(píng)估水質(zhì)，通過(guò)對(duì)標(biāo)注物質(zhì)和131個(gè)糞便和水質(zhì)樣品的分析，認(rèn)為ddPCR對(duì)抑制物的耐受程度比qPCR高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，具有更好的精確度和可重復(fù)性。 Pavi等[25]使用ddPCR和qPCR對(duì)未經(jīng)過(guò)DNA提取純化的細(xì)胞裂解液中的CMV進(jìn)行檢測(cè)，并與經(jīng)過(guò)提取的樣本結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)直接定量的結(jié)果具有重復(fù)性，考慮到核酸提取的效率及損耗，這可能與樣本中的實(shí)際病毒含量更接近。

此外，dPCR適用于準(zhǔn)確定量序列高度變異的靶標(biāo)。如針對(duì)同一種病毒，不同的引物/探針靶向不同的基因序列。在qPCR平臺(tái)上，不同引物/探針的擴(kuò)增效率差異及靶標(biāo)序列本身變異會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果有很大的差異[26]。而dPCR平臺(tái)不易受引物/探針結(jié)合位點(diǎn)的序列變化，能減少對(duì)定量結(jié)果的影響，提高檢測(cè)結(jié)果的一致性和可比性。

3.2 耐藥突變檢測(cè)

ddPCR可早期檢測(cè)痕量的病原微生物耐藥突變，不僅可減少無(wú)效藥物治療，還可在早期提示更換其他有效藥物，及時(shí)調(diào)整治療方案，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)感染性疾病的“精準(zhǔn)醫(yī)療”。這可能對(duì)感染性疾病的臨床研究和感染病患者的全程管理產(chǎn)生重要影響。Whale等[11]使用ddPCR檢測(cè)對(duì)奧司他韋耐藥的甲型流感病毒，其檢測(cè)限低至 0.1% 突變豐度，比臨床常用的qPCR高50倍。Taylor等[21]使用2009年新型甲型H1N1流感病毒野生株和對(duì)奧司他韋耐藥的H275Y點(diǎn)突變(神經(jīng)氨酸酶)H1N1毒株提取的RNA，比較qPCR與ddPCR在高豐度野生型H1N1背景下檢出H275Y的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ddPCR顯著提高了對(duì)突變病毒的檢測(cè)靈敏度(>30倍)。Mukaide等[27]對(duì)多態(tài)性病毒基因組中突變進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，建立了對(duì)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)核心氨基酸第70位點(diǎn)突變的ddPCR檢測(cè)方法，LoD達(dá) 0.005%，超過(guò)qPCR方法200倍。

3.3 基因編輯事件檢測(cè)

在慢性病毒病治療中，根除或控制病毒潛伏庫(kù)對(duì)患者停止抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療并實(shí)現(xiàn)治愈至關(guān)重要?；谵D(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)，特別是成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR 相關(guān)蛋白9(CRISPR-associated protein 9，Cas9)基因編輯技術(shù)刪除病毒基因[28-29]，條件性敲除病毒感染的宿主輔助受體(如CCR5[30]、內(nèi)源T細(xì)胞受體[31-32])，是頗有前途的病毒病基因治療方法。ddPCR可應(yīng)用于基于基因編輯的基因治療方法的開(kāi)發(fā)，能分析病毒顆粒水平[33]，還有助于基因編輯技術(shù)的優(yōu)化及質(zhì)量控制。ddPCR可有效地從高豐度野生型細(xì)胞中定量檢出特異性DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)介導(dǎo)的同源重組修復(fù)(homology-directed repair，HDR)，通過(guò)獨(dú)特的“Drop-off”引物探針設(shè)計(jì)策略，定量非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)事件[34-36]，從而加快篩選富集低豐度的基因編輯細(xì)胞[37]，評(píng)估向?qū)NA(guide RNA，gRNA)效率，優(yōu)化HDR∶HNEJ比例，還能評(píng)估基因編輯的脫靶率[33]。

3.4 基因連鎖分析

產(chǎn)志賀毒素型大腸埃希菌(shiga toxin-producingEscherichiacoli，STEC)可能引起人類(lèi)消化道疾病，其中腸出血性大腸埃希菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)感染嚴(yán)重時(shí)可致命。EHEC與其他可共生的大腸埃希菌或低毒的STEC很難通過(guò)生化特征區(qū)分，但EHEC同時(shí)含有志賀毒力基因stx1或stx2及編碼緊密黏附素的基因eae。經(jīng)典的選擇培養(yǎng)PCR檢測(cè)法會(huì)導(dǎo)致50%的假陽(yáng)性。McMahon等[38]利用ddPCR的納升級(jí)微滴直接包裹完整的細(xì)菌細(xì)胞，分析stx和eae基因同時(shí)出現(xiàn)的連鎖性(linkage)：如果stx1/stx2基因和eae基因存在于同一個(gè)細(xì)胞即EHEC細(xì)胞，則微滴呈雙陽(yáng)性；如果stx1/stx2和eae基因分別處于不同的細(xì)胞，則微滴呈單陽(yáng)性。雙陽(yáng)性微滴的數(shù)量只與樣本細(xì)菌密度有關(guān)。通過(guò)ddPCR的QuantaSoft軟件自動(dòng)計(jì)算連鎖率，可穩(wěn)定可靠地區(qū)分真假陽(yáng)性結(jié)果。

3.5 單細(xì)胞捕獲和分析

要實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV-1感染的治愈，主要挑戰(zhàn)是清除病毒潛伏庫(kù)。許多HIV-1根除策略基于“休克和殺滅”(shock and kill)的思路，需重新激活病毒潛伏庫(kù)，這也是HIV-1根除研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。但人們對(duì)HIV-1轉(zhuǎn)錄活性與重新激活的感染細(xì)胞數(shù)量之間的關(guān)聯(lián)知之甚少，現(xiàn)有的以細(xì)胞團(tuán)或組織塊為樣本的檢測(cè)手段無(wú)法將轉(zhuǎn)錄數(shù)量與細(xì)胞個(gè)體聯(lián)系起來(lái)，潛伏逆轉(zhuǎn)劑(latency reversing agent，LRA)可增加已激活的細(xì)胞中病毒轉(zhuǎn)錄水平，非活化的潛伏態(tài)感染的細(xì)胞被激活并重新表達(dá)HIV-1 RNA。Yucha等[39]通過(guò)ddPCR油包水微滴包裹單個(gè)CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腦源性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞水平直接對(duì)體外經(jīng)LRA處理后產(chǎn)生未剪切RNA和多重剪接RNA的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行定量，檢測(cè)數(shù)十萬(wàn)個(gè)CD4+T細(xì)胞中的HIV-1轉(zhuǎn)錄活性，并分析抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療中的HIV-1感染者的CD4+T細(xì)胞。他們分離了包含單個(gè)CD4+T細(xì)胞或8E5細(xì)胞和感染HIV的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的微滴，對(duì)基因組DNA和mRNA進(jìn)行定量。結(jié)果表明，經(jīng)HIV-1再激活的單個(gè)細(xì)胞數(shù)量與通過(guò)傳統(tǒng)測(cè)量方法獲得的總HIV-1 RNA水平無(wú)關(guān)，而LRA介導(dǎo)的usRNA和msRNA表達(dá)可能在臨床樣品間乃至單個(gè)細(xì)胞間存在異質(zhì)性。該研究突出了直接分析單個(gè)細(xì)胞的重要性，可更好地理解病原微生物與宿主細(xì)胞之間的相互作用。

4 結(jié)語(yǔ)

dPCR的主要技術(shù)特點(diǎn)是可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本中小概率事件的差異性檢測(cè)。dPCR的出現(xiàn)，特別是對(duì)ddPCR的應(yīng)用，將核酸分子的定量分析帶入無(wú)須標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)定量時(shí)代，有助于檢驗(yàn)結(jié)果的追溯和比較。dPCR對(duì)疾病相關(guān)核酸分子標(biāo)記的定量檢測(cè)，特別是對(duì)痕量靶標(biāo)分子的定量檢測(cè)，為疾病早期診斷、療效評(píng)估和預(yù)后提供了更具重復(fù)性和再現(xiàn)性的數(shù)據(jù)支持。在感染性疾病領(lǐng)域，未來(lái)對(duì)病原微生物的檢測(cè)很可能從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)、從定性到定量發(fā)展，治療也可秉持“精準(zhǔn)醫(yī)療”的理念，根據(jù)病原微生物的動(dòng)態(tài)變化適時(shí)調(diào)整治療方案，優(yōu)化對(duì)感染患者的全程管理。dPCR特別是ddPCR技術(shù)將為這個(gè)理念的實(shí)現(xiàn)提供重要的支撐。未來(lái)dPCR技術(shù)特別是更加靈活的ddPCR應(yīng)朝著高通量、自動(dòng)化、多通道、多功能的方向發(fā)展。