作用于種屬差異性表位的細(xì)菌α-半乳糖苷酶(EmGalase)的鑒定和研究

郭雅萌，侯琳琳，沈旦楓，鄒琳，王蕾，李天勝，孫桂芹，陳力

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院， 杭州 310053

異種輸血可以有效緩解人源血緊張的現(xiàn)狀，是生物醫(yī)學(xué)工程研究追求的方向。研究發(fā)現(xiàn)，人體IgG中有1%為抗異種(豬、鼠等)Galα1-3Gal表位的抗體，該抗體僅在人、猿和舊世界猴中發(fā)現(xiàn)[1]。由于異種表位的存在，人在接受異種來源血液時，會產(chǎn)生獨(dú)特的抗Galα1-3Gal反應(yīng)，這是導(dǎo)致人異種輸血超急性免疫排斥反應(yīng)的主因。針對這一技術(shù)難題，目前的解決辦法有兩種：一是利用基因敲除技術(shù)獲得缺失Galα1-3Gal表位的工程豬[2-3]，二是用α-半乳糖苷酶清除成熟豬紅細(xì)胞表面的Galα1-3Gal，以緩解抗原抗體反應(yīng)[4]。

α-半乳糖苷酶是一種常見糖苷水解酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，能夠水解糖脂和糖蛋白α連接的半乳糖殘基，可用于制備Galα1-3Gal陰性豬紅細(xì)胞。在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(Carbohydrate-Active enZYmes Database, CAZy)中[5]，α-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶類(glycoside hydrolases, GHs)。目前已知的α-半乳糖苷酶主要分布于GH4、27、36、57、97和110家族。不同家族α-半乳糖苷酶在酶學(xué)性質(zhì)等方面存在差異[6]。雖然α-半乳糖苷酶在醫(yī)療、食品與飼料等行業(yè)中已有較為廣泛的應(yīng)用，但是目前已見報(bào)道的能夠修飾豬紅細(xì)胞表面異種抗原的α-半乳糖苷酶主要有兩個：一個來自咖啡豆，屬于GH27家族[7]；另一個來自脆弱類桿菌，屬于GH110家族[4]。來自細(xì)菌GH27家族能夠修飾豬紅細(xì)胞表面異種抗原Galα1-3Gal的α-半乳糖苷酶目前未見報(bào)道。

腦膜炎敗血伊麗莎白金菌(Elizabethkingiameningoseptica，Em)是一種廣泛分布于自然界中的革蘭陰性菌，可能引起新生兒早產(chǎn)和不發(fā)達(dá)國家重癥監(jiān)護(hù)病房內(nèi)新生兒腦膜炎[8]，以及免疫缺陷成人院內(nèi)感染(肺炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎及術(shù)后菌血癥)[9-10]。2015年末美國威斯康星州暴發(fā)了該菌的感染[11]。2011年本實(shí)驗(yàn)室從一位收治于重癥監(jiān)護(hù)病房的T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的 15歲病人中分離到一株Em，命名為FMS-007。對其完成了完整基因組測序，建立了Em的國際標(biāo)準(zhǔn)基因組序列，該序列可作為Em基因組研究的理想模板[12]。在此基礎(chǔ)上，我們對Em展開糖苷酶功能基因組系統(tǒng)分析[13]，已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了糖苷酶有PNGase F-II[14]、cFase I[15]、cXase I等。

本研究的主要內(nèi)容是對FMS-007中作用于種屬差異性表位的α-半乳糖苷酶進(jìn)行基因克隆、表達(dá)和分析。研究發(fā)現(xiàn)，該酶屬于GH27家族，可用于制備Galα1-3Gal陰性的豬紅細(xì)胞，為應(yīng)急狀況下的異種輸血提供一種可能的工具。該酶被命名為EmGalase。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞FMS-007由本實(shí)驗(yàn)室保存，豬紅細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 儀器和試劑PrimeSTAR?Max DNA Polymerase和DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司；isoglobotriose和globoside Gb4購自青島曙格生物技術(shù)有限公司，Pkantigen購自ELICITYLC公司，顯色pNP底物購置于英國Carbosynth公司，isolectin B4 (BSI-B4-FITC)購自Sigma-Aldrich公司，1000 Touch梯度PCR儀和Sub-Cell GT水平電泳槽、Mini PROTEAN Tetra垂直電泳槽為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡ECLIPSE為尼康顯微公司產(chǎn)品，Legend Micro 17微量臺式離心機(jī)和NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1EmGalase基因的克隆、表達(dá)和純化模板基因組來源于實(shí)驗(yàn)室前期工作，即對FMS-007的完整基因組測序，得到一個總大小為 3 938 967 bp的完整圖譜。在CAZy數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，通過糖苷酶功能基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)FMS-007中存在一個GH27家族的α-半乳糖苷酶。以卡那霉素(kanamycin，Kana)抗性的pET28a(+)為載體，選擇NdeⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)上游引物 5′ -TCCATATGATGTTGTTTTCTCAAAAAGC-CAAAC-3′，下游引物5′-CGCTCGAGCTAAT-AAGTCTTCAGAACAATGATA-3′，6×His標(biāo)簽位于蛋白C端，重組質(zhì)粒命名為pET28a-EmGalase，由金唯智公司對克隆基因進(jìn)行序列分析。

將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-EmGalase轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體——大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，得到BL21(DE3)-pET28a-EmGalase表達(dá)菌，28 ℃ 160 rpm 小量誘導(dǎo)14 h，將誘導(dǎo)后的細(xì)胞破碎，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測上清液中的蛋白，目的蛋白相對分子質(zhì)量為 41 600。

將表達(dá)菌轉(zhuǎn)接至1 L LB培養(yǎng)基，37 ℃ 200 rpm培養(yǎng)至OD6000.6～0.8，用1 mL 1 mol異丙基硫代半乳糖苷大量誘導(dǎo)表達(dá)。以 7 500 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min后收獲細(xì)胞，重懸于60 mL 10 mM的咪唑中。將懸浮的大腸埃希菌細(xì)胞高壓破碎處理，在4 ℃條件下以 12 000 rpm轉(zhuǎn)速離心25 min，收集上清液中的細(xì)胞提取物，將上清液與提前準(zhǔn)備好的鎳柱在4 ℃條件下充分結(jié)合2 h后以400 rpm轉(zhuǎn)速離心2 min。將填料加至空柱中，期間用25 mmol咪唑沖洗2～3次，用1 mL不同濃度(50 mmol、100 mmol、200 mmol、500 mmol)咪唑緩沖液洗脫，并分別收集洗脫液。利用SDS-PAGE選擇擁有較純凈目的蛋白的洗脫液，用pH7.4 PBS作為透析液進(jìn)行透析。每隔6 h換1次透析液，一共4次，收集透析袋中的液體。使用Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2 EmGalase的底物特異性以及酶學(xué)性質(zhì)利用人工合成的14種pNP底物探究EmGalase的α-半乳糖苷酶活性及底物特異性，底物包括pNP-α-D-Gal、pNP-β-D-Lac、pNP-Xylosel、pNP-N-acetyl-α-D-Glc、pNP-β-D-Fuc、pNP-N-acetyl-β-D-Glc、pNP-N-acetyl-β-D-Gal、pNP-α-D-Glc、pNP-α-D-Man、pNP-β-D-Man、pNP-β-D-Gal、pNP-β-L-Fuc、pNP-β-D-Glc、pNP-N-acetyl-α-D-Gal，每種底物的濃度均為10 mmol。反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，對照組分別加入5 μL底物和45 μL PBS，實(shí)驗(yàn)組分別加入5 μL底物、43 μL PBS和2 μL EmGalase。在37 ℃反應(yīng)30 min后，分別加入75 μL 1 mol的Na2CO3終止反應(yīng)，測量OD405用于判斷EmGalase與不同底物的反應(yīng)能力。

按表1制作EmGalase標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個體系為60 μL，在pH 7.4 PBS中進(jìn)行。在37 ℃反應(yīng)30 min，用75 μL 1 mol的Na2CO3終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測量OD405并制作關(guān)于OD405和pNP濃度的回歸直線。EmGalase的最適pH值實(shí)驗(yàn)：每孔加入53 μL pH 7.4 PBS、5 μL 10 mmol的pNP-Gal、2 μL EmGalase，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH分別至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，在37 ℃反應(yīng)30 min，用 75 μL 1 mol Na2CO3終止反應(yīng)，測量OD405用于判斷EmGalase在不同pH值條件下的反應(yīng)能力。

表1 pNP濃度梯度

Tab.1 Different gradient concentrations of pNP

ABCDEFGHConcentrations of pNP(mmol)00.015 6250.031 250.062 50.1250.250.51

EmGalase的最適溫度實(shí)驗(yàn)：每孔加入54 μL pH 7.4 PBS、5 μL 10 mmol pNP-Gal、1 μL EmGalase，分別置不同溫度條件下(4、20、30、37、45、55、65、75、85 ℃)反應(yīng)15 min，用75 μL 1 mol Na2CO3終止反應(yīng)，測量OD405用于判斷EmGalase在不同溫度條件下的反應(yīng)能力。

不同金屬離子及化合物對EmGalase的影響：選取96孔板中10個孔，每孔加入1 μL EmGalase、5 μL pNP-Gal、43.5 μL pH6.8 CH3COONH4，1～10孔分別加入0.5 μL濃度為1 mol的 Zn2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+及化合物EDTA、SDS，使不同離子或化合物在每孔50 μL反應(yīng)體系中的終濃度為10 mmol。在37 ℃反應(yīng)30 min，用75 μL 1 mol的Na2CO3終止反應(yīng)，測量OD405用于判斷EmGalase在金屬離子及試劑影響下的反應(yīng)能力。

EmGalase米氏常數(shù)曲線：每孔添加49 μL用PBS稀釋的不同濃度(0、0.2、0.4、0.8、1、2、3、4 mmol)的pNP-α-Gal及1 μL 0.25 mg/mL 的EmGalase，在37 ℃反應(yīng)15 min，用75 μL 1 mol Na2CO3終止反應(yīng)，測量OD405用于判斷EmGalase釋放Gal的能力大小。

EmGalase酶切不同寡糖底物的質(zhì)譜檢測: 取10 mmol寡糖底物各1 μL，分別加入1 μL 0.25 mg/mL的EmGalase及9 μL pH4 CH3COOH，37 ℃反應(yīng)3 h。每個反應(yīng)產(chǎn)物加200 μL去離子水稀釋后，用LTQ Orbitrap XL高分辨串聯(lián)多級質(zhì)譜進(jìn)行檢測。

EmGalase酶切不同寡糖底物的D-Galactose kit檢測：按照試劑盒的要求準(zhǔn)備樣品，即每個體系含有2 μL EmGalase，3.11 μL 10 mmol寡糖底物和8.89 μL pH7.4 PBS，37 ℃反應(yīng)2 h。

按照表2配制檢測體系，加樣于96孔板，輕混勻。30 ℃作用3 min后，檢測OD340，記為A1。之后每孔加入2 μL β-GalDH/GalM后，輕混勻，30 ℃放置6 min后讀取OD340，并記為A2。隨后每隔 1 min讀取OD340至讀數(shù)穩(wěn)定。樣品μg=ΔAsample/ΔAstandard × 4 μg standard。

表2 試劑盒檢測體系

Tab.2 Kit detection system

ComponentBlank (μL)Sample (μL)standard (μL)distilled water210200200sample solution/10/standard solution//10solution 1 (buffer)202020solution 2 (NAD+)101010

1.2.3 EmGalase對豬紅細(xì)胞Galα1-3Gal表位的作用將采集的豬血與CPDA-1血液保存液按照10∶1.5比例混合。4 000 rpm離心7 min并去除上清液和白細(xì)胞層，余下紅細(xì)胞與CPDA-1按照 10∶1.5比例混合,重懸紅細(xì)胞。取1 mL 10%的紅細(xì)胞懸液，1 500 rpm離心2 min，用PCBS(60 mmol NaH2PO4, 25 mmol NaCitrate, 75 mmol NaCl)洗滌2次，并調(diào)至40%壓積備用。

顯微鏡鏡檢：EmGalase酶切豬紅細(xì)胞的鏡下觀察實(shí)驗(yàn)按照表3加樣。

表3 豬紅細(xì)胞的酶切體系(鏡檢)

Tab.3 Enzyme digestion system of porcine erythrocytes (Microscopic examination)

Component1240% porcine erythrocytes (μL)4040PCBS(μL)40/EmGalase(μL)/40

室溫反應(yīng)1 h后，將紅細(xì)胞 1 500 rpm離心2 min，pH7.4 PBS洗滌2次，并調(diào)至10%壓積。取10 μL紅細(xì)胞與2 μL BSI-B4混合于載玻片上，顯微鏡(10×40)下觀察。

流式細(xì)胞儀檢測：按照表4設(shè)置不同的組別進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)。

表4 豬紅細(xì)胞的酶切體系(流式檢測)

Tab.4 Enzyme digestion system of porcine erythrocytes (flow cytometry)

Component12340% porcine erythrocytes (μL)404040PCBS(μL)4040/EmGalase(μL)//40

室溫反應(yīng)1 h，期間液體保持混勻狀，無沉降。反應(yīng)后每管加200 μL pH7.4 PBS，1 500 rpm離心2 min，洗滌2～3次，200 μL pH 7.4 PBS重懸，取30 μL重懸液，加500 μL 0.1%戊二醛固定不超過15 min，pH 7.2 PBS洗滌2～3次，200 μL pH 7.2 PBS重懸。BSI-B4-FITC按表5進(jìn)行分組添加。

表5 各組別的凝集素處理

Tab.5 BSI-B4-FITC treatment in each group

Component123BSI-B4-FITC(μL)/33pH 7.2 PBS(μL)3//

避光反應(yīng)1 h，期間液體保持混勻狀，無沉降。反應(yīng)后用pH 7.2 PBS洗2～3次，稀釋到一定細(xì)胞數(shù)后，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司生產(chǎn))進(jìn)行熒光檢測。

1.2.4 EmGalase對人B型紅細(xì)胞Galα1-3(Fucα1-2)Gal表位的作用取1 mL 10%的B型紅細(xì)胞懸液置1.5 mL EP管中，1 500 rpm離心 2 min，去上清液，PCBS洗滌2次，調(diào)至40%壓積。EmGalase對B型紅細(xì)胞修飾的實(shí)驗(yàn)按表6配制反應(yīng)體系。室溫反應(yīng)1h后，將紅細(xì)胞用pH7.4 PBS以 1 500 rpm轉(zhuǎn)速離心2 min，洗滌2次后，將紅細(xì)胞調(diào)至10%壓積。取10 μL紅細(xì)胞與2 μL 抗B型抗原抗體混合于載玻片上，顯微鏡(10×40)下觀察。

表6 人B型紅細(xì)胞的酶切體系

Tab.6 Enzyme digestion system of human B blood group red blood cells

Component1240% B-type red blood cell (μL)4040PCBS(μL)40/EmGalase(μL)/40

2 結(jié)果

2.1 EmGalase基因的克隆、表達(dá)和純化

借助CAZy數(shù)據(jù)庫對FMS-007糖苷酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個GH27家族的α-半乳糖苷酶EmGalase。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，EmGalase與已報(bào)道的兩個可以修飾豬紅細(xì)胞的酶(Coffea arabica GH27和 Bacteroides fragilis NCTC 9343 GH110)有顯著差異(圖1)。EmGalase基因序列長為 1 104 bp，測序鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將重組質(zhì)粒pET-28a+-EmGalase轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。純化后的EmGalase相對分子質(zhì)量為 41 600，在SDS-PAGE中顯示為單一條帶，純度在95%以上(圖2)。純化的蛋白濃度為1～2 mg/mL(Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒測定)。

圖1 EmGalase與代表性α-半乳糖苷酶的系統(tǒng)發(fā)生樹分析

Fig.1 Phylogenetic tree of EmGalase in representative alpha galactosidase

Lane 1: PageRuler Prestained Protein Ladder. Lanes 2, 3, 4 and 5: EmGalase eluted with different concentrations of imidazole.

圖2 EmGalase純化及SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified EmGalase

2.2 EmGalase的酶學(xué)性質(zhì)

為驗(yàn)證EmGalase是否具有α-半乳糖苷酶活性，我們用純化的EmGalase處理人工合成的pNP單糖底物。結(jié)果顯示EmGalase可水解pNP-α-Gal，但對其他底物無反應(yīng)性，提示EmGalase是具有α-Gal特異性的糖苷水解酶(圖3)。EmGalase的催化常數(shù)Kcat為2.17 s-1，米氏常數(shù)Km為0.22mmol，Kcat/Km為9.86 L/s·mmol，Vmax為0.19 μmol/s(圖4)。

圖3 EmGalase與pNP底物的反應(yīng)

Fig.3 The reaction between EmGalase and pNP substrate

A:Standard curve. B: Michaelis constant curve.

圖4 EmGalase反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與米氏常數(shù)曲線

Fig.4 Standard curve and Michaelis constant curve related to EmGalase

EmGalase在pH3.0～8.0均表現(xiàn)出較高的反應(yīng)活性(圖5A)，活性反應(yīng)的適宜溫度區(qū)間為4～45 ℃(圖5B)。與對照相比，在相同反應(yīng)條件下另外加入10 mmol濃度的金屬離子時，Zn2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+、K+和Ca2+對EmGalase的半乳糖苷酶活性無明顯影響，而Cu2+和Fe2+對酶活性有一定程度的抑制作用(表7)。

表7 金屬離子和化合物對EmGalase反應(yīng)活性的影響

Tab.7 Effect of ions and compounds on EmGalase

ReagentsConcentration (mmol)Relative activity(%)K+10101.07Mn2+10117.64Mg2+10102.25Ni2+10101.77Zn2+1098.62Ca2+1096.04Cu2+1073.07Fe2+1047.81EDTA1096.42SDS1083.62

為了確認(rèn)EmGalase所酶切的α-糖苷鍵特性，我們用該酶處理不同連接方式的寡糖，利用質(zhì)譜和試劑盒分析反應(yīng)產(chǎn)物。

質(zhì)譜結(jié)果顯示，EmGalase能夠酶切直鏈末端α-1,3、1,4、1,6連接的半乳糖。在酶切Galα1-3Galβ1-4Glc三糖的實(shí)驗(yàn)中，對照組使用高溫失活EmGalase，檢測到m/z 527.16處的分子離子峰，其表示該三糖的鈉加合物。通過EmGalase處理后該峰消失，在m/z 365.11和203.05處出現(xiàn)兩個強(qiáng)質(zhì)量離子峰，表示有Galβ1-4Glc二糖的鈉加合物和單糖Gal的鈉加合物(圖6A)。在對Galα1-4Galβ1-4Glc三糖進(jìn)行處理時也得到了類似的結(jié)果，EmGalase使得三糖的m/z 527.16峰轉(zhuǎn)變?yōu)槎堑膍/z 365.11和單糖的m/z 203.05(圖6B)。在使用蜜二糖Galα1-6Glc作為底物并用高溫失活EmGalase進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)時，可以觀察到m/z 365.11的鈉加合物；當(dāng)用EmGalase處理之后，二糖峰消失，轉(zhuǎn)變?yōu)閙/z 203.05 Gal和Glc混合的單糖峰(圖6C)。上述結(jié)果提示，EmGalase既能酶切直鏈末端α-1, 3連接的半乳糖，又能酶切α-1,4和α-1,6連接的半乳糖(圖6)。

A:EmGalase optimum pH. B: EmGalase optimum temperature.

圖5 EmGalase最適pH和最適溫度

Fig.5 EmGalase’s optimum pH and optimum temperature

對水解后的單糖底物進(jìn)行分析(D-Galactose kit)發(fā)現(xiàn)，在相同反應(yīng)條件下，EmGalase能夠不同程度地水解直鏈末端α-1,3、1,4、1,6Gal，實(shí)驗(yàn)中未檢測到EmGalase對 α-1,4連接的半乳糖寡糖的酶切活性(表8)。

A:Before and after EmGalase digestion of Galα1-3Galβ1-4Glc(isoglobotriose). B: Before and after EmGalase digestion of Galα1-4Galβ1-4Glc(Pkantigen). C: Before and after EmGalase digestion of Galα1-6Glc(melibiose).

圖6 EmGalase處理寡糖底物后產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測

Fig.6 Mass Spectrometric Detection of Oligosaccharide Substrate digested by EmGalase

表8 EmGalase對不同寡糖底物的反應(yīng)性

Tab.8 EmGalase reactivity to oligosaccharide substrates

SubstrateRelative activity(%)Gal-α-pNP96.67Galα1-3Galβ1-4Glc(isoglobotriose)48.56Galα1-4Galβ1-4Glc(Pk antigen)58.85Galα1-6Glc(melibiose)81.85GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc (globoside Gb4)ND

ND: means not detectable.

2.3 EmGalase對豬紅細(xì)胞Galα1-3Gal表位的作用

在PCBS溶液中，用EmGalase處理豬紅細(xì)胞表面Galα1-3Gal表位，并用特異性結(jié)合末端α-Gal的凝集素BSI-B4進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，未經(jīng)酶解處理的豬紅細(xì)胞與BSI-B4發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)，產(chǎn)生大小不一的團(tuán)塊；而經(jīng)EmGalase處理后的豬紅細(xì)胞與BSI-B4混合后，多個視野觀察下未見任何凝集現(xiàn)象。結(jié)果提示EmGalase能夠有效清除豬紅細(xì)胞表面異種Galα1-3Gal表位。

為了進(jìn)一步證實(shí)EmGalase的清除是否徹底，我們用BSI-B4-FITC進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在經(jīng)過酶切處理前，由于豬紅細(xì)胞表面存在大量的末端Galα1-3Gal，因此會與BSI-B4-FITC結(jié)合并檢測到很強(qiáng)的熒光信號。而經(jīng)EmGalase酶切處理后，豬紅細(xì)胞與BSI-B4-FITC失去結(jié)合作用，其信號與無熒光的細(xì)胞對照信號基本一致，表明在實(shí)驗(yàn)條件下EmGalase能以95%以上的效率清除豬紅細(xì)胞表面Galα1-3Gal表位(圖8)。

2.4 EmGalase對人B型紅細(xì)胞Galα1-3(Fucα1-2)Gal表位的作用

B型紅細(xì)胞表面B抗原糖鏈末端存在Galα1-3(Fucα1-2)Gal表位[16]，該表位上的末端α-Gal可被已報(bào)道的兩個α-半乳糖苷酶清除。在PCBS溶液中，用EmGalase酶切處理人B型紅細(xì)胞后，再用抗B血型抗原的單克隆抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，沒有EmGalase處理的B型紅細(xì)胞與抗B抗原抗體發(fā)生強(qiáng)凝集反應(yīng)，產(chǎn)生大小不一的團(tuán)塊；而經(jīng)EmGalase處理后的人B型紅細(xì)胞與抗B抗原抗體混合后，在多個視野下仍然可觀察到凝集現(xiàn)象(圖9)。提示EmGalase對人B型紅細(xì)胞上的Galα1-3(Fucα1-2)Gal表位無作用(不同酶用量及反應(yīng)條件下均無效果，結(jié)果未顯示)。

A:Untreated porcine red blood cells together with BSI-B4. B: EmGalase-treated porcine erythrocytes are associated with BSI-B4.

圖7 EmGalase對豬紅細(xì)胞Galα1-3Gal介導(dǎo)凝集反應(yīng)的影響(10×40)

Fig.7 Effect of EmGalase treatment on porcine erythrocytes Galα1-3Gal mediated agglutination (10×40)

NC: non-specific control. P: Untreated porcine red blood cells together with BSI-B4. P-EmGalase: EmGalase-treated porcine erythrocytes are associated with BSI-B4.

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測EmGalase對豬紅細(xì)胞Galα1-3Gal的酶切活性

Fig.8 Flow cytometry to detect EmGalase activity on porcine erythrocytes Galα1-3Gal

3 討論

α-半乳糖苷酶常見于植物、動物和微生物中，而 此前未有關(guān)于Em的α-半乳糖苷酶報(bào)道。

A:Untreated B-type red blood cells together with B antibody. B: EmGalase-treated B-type red blood cells together with B antibody.

圖9 EmGalase對人B型紅細(xì)胞Galα1-3(Fucα1-2)Gal介導(dǎo)的凝集反應(yīng)的影響(10×40)

Fig.9 Effect of EmGalase treatment on human B red blood cell Galα1-3(Fucα1-2)Gal mediated agglutination (10×40)

EmGalase屬于GH27家族，與GH4、GH36、GH57、GH97和GH110家族的α-半乳糖苷酶在進(jìn)化上有著明顯的差異。以pNP-α-Gal為底物，該酶在pH3.0～8.0之間都有較高的活性，尤以pH7.0時最優(yōu)；反應(yīng)溫度在4～45 ℃，以20 ℃時的反應(yīng)效果更好。EmGalase的反應(yīng)pH值和溫度范圍較其他來源的同族半乳糖苷酶更廣泛[6]，最適反應(yīng)條件溫和，可以適應(yīng)不同處理?xiàng)l件的要求。除銅離子和亞鐵離子之外，其他常見金屬離子的存在并不會影響EmGalase的活性。

在實(shí)驗(yàn)條件下，EmGalase能夠以>95%的效率清除豬紅細(xì)胞表面Galα1-3Gal表位，但對B型紅細(xì)胞表面相似的Galα1-3(Fucα1-2)Gal抗原不起作用。EmGalase是第1個細(xì)菌來源可以作用于豬紅細(xì)胞表面Galα1-3Gal表位的GH27家族α-半乳糖苷酶。2003年，Wang等用植物咖啡豆來源的GH27家族α-半乳糖苷酶修飾豬紅細(xì)胞表面Galα1-3Gal表位[17]。2012年，Liu等報(bào)道脆弱類桿菌中α-半乳糖苷酶也能夠作用于豬紅細(xì)胞，屬GH110家族。這兩個酶存在共同的隱患是它們也能夠清除存在于人類紅細(xì)胞上B抗原Galα1-3(Fucα1-2)Gal的末端α-Gal[18-20]。與之相比，EmGalase專一性處理豬紅細(xì)胞表面的異種抗原，將會降低在應(yīng)急情況下異種輸血中可能存在的不確定性。

事實(shí)上，末端半乳糖基化不僅是一種常見的免疫原，它在細(xì)菌的感染過程中也起著重要作用。革蘭陰性菌脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)由脂質(zhì)A、核心多糖和O抗原組成[21]。研究表明，在以肺炎克雷伯菌為代表的一些細(xì)菌中，LPS的O抗原上存在末端α-1,3Gal結(jié)構(gòu)[22-23]。這一結(jié)構(gòu)在細(xì)菌感染過程中所起的作用有待進(jìn)一步探究，EmGalase的酶切活性將為研究該過程提供一種工具。研究表明，在腎臟和腸道中存在末端α-1,4Gal，該結(jié)構(gòu)可能成為志賀菌所產(chǎn)生的志賀毒素特異性黏附作用的靶點(diǎn)[24]，由此進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生毒素作用。EmGalase處理靶細(xì)胞是否能夠阻斷病原體的感染也是一個可能的研究方向。

綜上所述，本研究克隆并表達(dá)了Em中GH27家族的α-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)條件溫和，可作為工具酶有效清除豬紅細(xì)胞表面半乳糖相關(guān)的異種抗原，為應(yīng)急情況下的異種輸血提供一種新的途徑。該酶在外源細(xì)胞與宿主相互作用中的應(yīng)用值得進(jìn)一步關(guān)注和研究。