不同PRRS弱毒苗免疫血清對FcγRIIb介導ADE效應的影響

余建國 曾容愚

（1.金華職業技術學院 浙江金華 321007；2.天康生物股份有限公司 烏魯木齊 832003）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由PRRSV引起的豬的一種繁殖障礙和呼吸道傳染病。臨床以商品豬表現呼吸障礙，懷孕母豬表現死胎、木乃伊胎、弱胎。該病于1987年在美國首次被報道[1]，德國、英國、荷蘭、西班牙等歐洲國家相繼報道了該病的發生，進而在全球的養豬國家暴發了該病。該病病原為PRRS病毒（PRRSV），荷蘭學者首次分離到歐洲型PRRSV代表毒株，北美學者相繼分離到北美型PRRSV代表毒株ATCC-VR2332。郭寶清等于1996年在我國首次分離到該病毒。

抗體依賴性增強作用 （Antibody-dependent enhancement，ADE）是指某些病毒以對應特異抗體處理后，病毒復制或感染能力顯著增強的現象。宿主被病毒感染后，免疫系統可以產生相應的免疫應答反應。此時產生的針對病毒表面蛋白的特異性抗體常常可以阻止病毒粘附于宿主細胞表面，使其失去感染細胞的能力。然而在有些情況下，抗體在病毒感染過程中卻發揮相反的作用，它們協助病毒進入靶細胞，提高感染率，這一現象就是抗體依賴性增強（ADE）作用，在用肺泡巨噬細胞培養PRRSV時，加入少量血清可顯著提高病毒復制水平[2]。對藍耳病病毒的ADE現象發現相對較晚，病毒大多表現為嗜好在巨噬細胞中繁殖和容易引發宿主的持續性感染，用常規疫苗免疫來防控這類具有ADE效應的病毒病時常常難以奏效，一般認為：ADE作用是影響PRRS疫苗效果的主要障礙和研發疫苗必須考慮的主要因素。

ADE現象最早由Hawkes在20世紀60年代報道[3]。仇華吉等研究指出，注射亞水平的PRRSV中和血清滴度，比注射中和水平的IgG更容易誘發豬發生病毒血癥[4]；田克恭等研究了血清對感染PRRSV的巨噬細胞中病毒顆粒增殖數量影響，結果表明含有亞中和水平PRRS抗體的抗體處理組與PRRS抗體陰性血清處理組相比差異極顯著，即當PRRS抗體低水平存在時，病毒的增殖顯著增強[5]。一般認為：Fc受體（FcR）介導的ADE作用被認為是最常見的ADE作用機制[6]。此外，病毒-抗體-補體復合物通過與靶細胞上的CR2作用增強了粘附；病毒粒子上補體成分的沉積有助于病毒囊膜與細胞膜的融合；通過FcR或CR，使補體活化產物和細胞內的信號轉導對靶細胞產生刺激效應 （例如增強胞吞作用），抗體或可溶性CD4在中和濃度以下時可以使gp120活化，促進病毒囊膜與細胞膜的融合。當血清不能完全中和病毒時，抗原抗體復合物通過FcγR介導，病毒對宿主細胞的侵入能力增強，從而表現低抗體水平時，發病率增加。

PRRS弱毒苗誘導抗體依賴性增強作用（ADE）效應，被認為是影響疫苗效果的障礙之一。豬群受到PRRSV野生毒株感染后，群體內免疫水平參差不齊，不同個體的ADE差別很大；另外，通過母源抗體獲得對PRRS被動免疫的仔豬，一旦抗體水平下降至保護性水平以下（亞中和水平），PRRSV就會表現ADE活性，從而增加動物感染和發病的危險。PRRSV的ADE效應與感染細胞表面的Fc受體（FcγRIIb）介導有關，楊青原等研究證實：用 FcγRIIb多抗能夠弱化ADE效應[7]。但該研究未確認臨床常用疫苗與Fc受體介導的關聯性，也未提示不同疫苗抗體在弱化效果中是否存在差異性。

PRRSV具有嚴格的細胞嗜性，肺泡巨噬細胞（Pulmonary alveolar macrophage，PAM） 為其天然靶細胞。本試驗擬以三種不同藍耳病弱毒苗為對象，以PAM細胞感染為載體，研究不同抗體免疫復合物對FcγRⅡb受體介導ADE效應的影響，并探索其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與試驗動物 HP-PRRSV田間分離株（ZJ-2014株，TCID50為 105.0/0.1mL）由上海獸醫研究所惠贈；PRRSV雙陰性25日齡健康仔豬45頭，購自金華某豬場。

1.1.2 疫苗及抗體 HP-PRRS弱毒苗蘭特威（TJM-F92株，北京某公司生產）；藍克清（R98株，南京某生物技術公司生產）；藍定抗（CH-1R株，福建某公司生產，市購）。IgG、兔抗豬IgG、PRRSV特異性抗體 IgG、兔抗豬FcγRⅡ血清，均由上海獸醫研究所獸醫微生物研究室惠贈。

1.1.3 主要試劑 DNTPs、GraphPad Prism5軟件等市購；新生犢牛血清為上海快靈生物工程有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 PAM細胞制備 選25日齡健康仔豬，放血致死后無菌摘取豬肺臟，在肺器官側壁剪開一個端口，止血鉗夾住端口稍下位置，用含2 000 IU青霉素、鏈霉素的1640營養液清洗肺臟，灌洗時注入約100 mL1640（以滅菌紗布包裹血管口，以防血液進入收集瓶），連續多次，直至洗出的1640液透明清亮。將灌洗液2 000 r/min離心20 min，用1640液重懸洗滌PAM細胞2次，最后加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養液中，調整細胞濃度至106個/mL，加入24孔細胞培養板中，0.5 mL/孔，37℃約6 h，棄去未貼壁的細胞，用DPBS洗板1次，加入新的營養液置于37℃培養。培養2 h后從細胞培養箱中取出細胞板，棄掉舊培養液，用PBS輕輕潤洗2次，加入新的RPMI1640完全培養液。以后每24 h更換1次新鮮培養液，連續培養20 d。

將培養皿中的細胞培養液棄掉，用PBS沖洗2遍后，加入0.25%胰酶消化4 min后加入完全培養基終止反應，將細胞懸液移至15 mL離心管中，1 000 r/min，離心5 min，棄去上清，將4℃預冷的凍存液加入15 mL離心管中，吹打使細胞重懸于凍存液中，分裝于細胞凍存管中(1 mL/管)并標記，使用前經解凍復蘇備用。

1.2.2 疫苗免疫血清復合物的制備 將2.68 mg/mL豬 PRRSV陽性 IgG作倍比 （21～24）稀釋后，與200 TCID50/100μL病毒液等體積混合均勻，在37℃孵育60 min，制成三種不同濃度的疫苗免疫復合物。

1.2.3 不同濃度特異性抗體PRRSV增殖影響試驗將上述1.2.2方法中倍比稀釋的三種疫苗血清復合物接種到PAM 細胞上，每孔200 μL。并設置接毒細胞對照（對照組加陰性血清），接毒細胞加入200個TCID50的 PRRSV（ZJ-2014 株）病毒液 200 μL。每個稀釋度做3孔平行對照。37℃吸附1 h后棄去上清，用滅菌PBS液漂洗1次，而后加入含10%血清的RPMI1640 培養液，0.5 mL/孔，5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養。補加含10%新生牛血清的RPMI1640細胞營養液各0.3 mL，置37℃、5%CO2培養箱中分別培養24 h和48 h后取出細胞培養板，-20℃凍存。裂解PAM細胞后提取細胞RNA，用段二珍等建立的PRRSV實時定量PCR檢測方法，檢測PRRSV拷貝數[8]。

1.2.4 PRRSV在不同時間段的增殖 將濃度為1.30 mg/mL的三種疫苗血清免疫復合物分別處理PAM細胞，并設置接毒細胞對照（對照組以陰性血清處理PAM細胞），接毒細胞加入200個TCID50的PRRSV（ZJ-2014 株）病毒液 200 μL。

1.2.5 FcγRⅡb多抗阻斷Fc介導ADE作用試驗用含10%新生牛血清的1640培養基將PAM細胞稀釋至106個/mL，按500 μL/孔接種到24孔細胞培養板中，置37℃、5%CO2細胞培養箱中培養過夜。待細胞貼壁牢固，吸去培養基，用無菌PBS輕輕漂洗2次。向試驗組每孔加入1：100倍稀釋的兔抗豬FcγRⅡ血清 （經56℃、30 min以消除補體作用，其余孔加無血清1640培養液，500 uL/孔，37℃下作用1 h后倒掉血清和培養基，用PRRSV（ZJ-2014株）病毒 104.8TCID50與 1：128稀釋的抗 PRRSV陽性血清混合（每種疫苗血清做三個平行對照），37℃下孵育1 h，加入細胞板中，每孔500 uL。

設病毒感染對照，37℃、5%CO2條件下培養 1 h后，棄掉病毒與抗體復合物，加入含2%新生牛血清的培養基作為維持液。感染24 h后收毒，用PAM細胞測定病毒的TCID50，計算收獲病毒量的差異，檢測兔抗豬FcγRⅡ血清對ADE的阻斷效果。

1.2.6 數據處理方法 PRRSV拷貝數通過建立的標準曲線進行進行絕對定量檢測。數據運用GraphPad Prism5軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同濃度疫苗血清對PRRSV增殖的影響 以PRRSV實時定量PCR方法，分別檢測感染各組PRRSV的RNA水平。參照說明書推薦的25 μL反應體系：SYBRPremix Ex Taq （Tli RNaseH Plus）12.5 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各 0.5 μL、cDNA 2 μL，加ddH2O補至25 μL。 每個樣品做3個重復，并選擇3孔不加樣品只加水作為陰性對照。各管充分混勻置于Eppendorf Mastercycler ep realplex 4熒光定量PCR儀中。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火34 s，共40個循環。mRNA的相對表達水平采用2-△△Ct計算分析。

當免疫復合物作1：4稀釋時，PRRSV在PAM細胞中的增殖數量明顯增多，當濃度為0.68 g/L時，PRRSV增殖速度比純病毒感染PAM細胞顯著提高，病毒含量相差約20.5倍。試驗提示：一定濃度的疫苗抗體能夠顯著增強PRRSV的增殖（見圖1）。

2.2 PRRSV在不同時間段的增殖情況 同一稀釋度下 （0.68 g/L），疫苗免疫復合物在PRRSV感染PAM 細胞的不同時間（12、24、36 、48 h）內，能促進PRRSV的增殖，在感染48 h時PAM細胞中的病毒含量較無感染性免疫復合物組高18.47～87.25倍，在感染36 h時PAM細胞中的病毒含量較無感染性免疫復合物組PRRSV增殖差異最大達到88.25倍，說明質量濃度為0.68 g/L感染性免疫復合物在48 h內能夠增強PRRSV的增殖，在36 h時作用最強（見圖 2）。

圖1 不同濃度疫苗血清對PRRSV增殖的影響

圖2 不同時間段PRRSV增殖情況

2.3 FcγRⅡb多抗阻斷PAM介導ADE作用結果FcγRⅡb多抗對三種疫苗免疫復合物誘發的ADE效應都有一定的弱化作用，其中TJM-F92株免疫血清的ADE效應最弱，可能是該毒株疫苗結構片段與FcγRⅡb的結合能力有關。

圖3 三種疫苗血清對ADE效應的弱化作用

3 討論與小結

1）據報道，PRRSV只在表達的FcγRⅡ細胞才發生ADE現象，本試驗在選取試驗材料時充分考慮了這一觀點。研究發現，免疫血清能通過FcγR介導增強靶細胞的吞噬作用，使得抗原-抗體復合物更易進入胞內[9]。IgG能激活巨噬細胞表面的Fc段IgG受體并與其結合，從而增加PRRSV進入巨噬細胞的機會，增強巨噬細胞的易感性。試驗結果提示，三種疫苗血清均能影響FcγRⅡb多抗處理過的病毒增殖反應，弱化ADE效應，說明三種疫苗血清IgG均存在FC受體活性片段，這與上述研究結論是一致的。

2）TJM-F92疫苗株（NSP2基因缺失）免疫豬體后，能較好地刺激機體產生IL-12，從而抑制野毒在患豬體內的復制。PRRSV感染后的PAM細胞，炎性因子IL-12的生長會受到抑制。IL-12是促進細胞介導免疫應答的細胞因子，同時還可以調節T細胞和巨噬細胞的分化，實現對體內PRRSV復制的抑制效應。研究發現：PRRSV抑制宿主機體產生IL-12，用重組豬IL-12體外刺激感染PRRSV的豬肺泡巨噬細胞（PAMS）后，細胞中IFN-γ水平升高，豬肺泡巨噬細胞中PRRSV滴度降低[10]。

3）本試驗中TJM-F92株疫苗血清對ADE效應表現出較好的弱化效果，推測是該疫苗在刺激抗體產生的同時，一方面它對機體產生IL-12的活性作用較強；另一方面在該疫苗刺激下影響調控信號通路。有報道認為，NSP2基因缺失會降低TLR2和TLR4的分泌，從而使豬體內FcγRⅡ受體蛋白表達增強，因此表現了超強的ADE弱化效應。是否還存在其他機制，有待進一步研究。