一株致病性糞腸球菌的分離與鑒定

范 輝 將樂縣動物疫病預防控制中心 福建將樂 353300

腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的一部分，通常在引起腹腔和盆腔感染所分離的混合菌中發(fā)現，以往認為腸球菌是對人類無害的共棲菌，但近年研究已證實了腸球菌的致菌力。在需氧革蘭氏陽性球菌中，它是僅次于葡萄球菌的重要院內感染致病菌，腸球菌亦可引起院外感染。腸球菌不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內膜炎和腦膜炎等[1]。本試驗的病原菌分離自1羽發(fā)病雛雞的肝臟及心臟。

1 病原菌的分離與鑒定

1.1 材料和方法

1.1.1 材料 病料來源于1羽發(fā)病雛雞，其癥狀表現為精神沉郁，羽毛蓬松，步態(tài)不穩(wěn)，剖檢可見卵黃吸收不良，肝臟土黃色，其他未見明顯變化。病菌即分離自該雛雞的肝臟及心臟。

1.1.2 方法

1.1.2.1 培養(yǎng)基的制備 血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、普通瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，按常規(guī)方法制備，滅菌，4℃冰箱保存，備用。

1.1.2.2 細菌分離 無菌取患雞心臟及肝臟于血平板瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)24 h。而后，挑取形態(tài)一致的菌落進行純培養(yǎng)。

1.1.2.3 形態(tài)學觀察 將純培養(yǎng)細菌涂片，進行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細菌形態(tài)和著色情況。

1.1.2.4 生化試驗 純化后的細菌分別進行吲哚、MR、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、尿素分解酶試驗、枸櫞酸鹽利用試驗及三糖鐵培養(yǎng)基接種試驗。

1.1.2.5 藥敏試驗 將純培養(yǎng)菌液調至0.5個麥氏單位，取該菌液0.1 mL，均勻涂滿普通瓊脂平板，藥敏片均勻貼于瓊脂上，不得移動。

1.1.2.6 動物試驗 分離菌株18 h血清肉湯培養(yǎng)物離心后，取其菌體，分別腹腔注射體重15～20 g的小白鼠4只(劑量0.2 mL/只)，設對照組3只；頸部注射1日齡雛雞15羽，設對照組3羽。注射后定時觀察、記錄。死后剖檢，并分離細菌。

1.2 結果

1.2.1 形態(tài)觀察和培養(yǎng)特性 剖檢病料經涂片、鏡檢可見有少量圓形或橢圓形、呈單在或短鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌。從肝臟及心臟中分離得到的菌株在血平板上經37℃培養(yǎng)24 h后，形成灰白色、不透明、表面光滑、直徑0.5～1 mm的圓形菌落，有溶血現象；經涂片、染色后，鏡檢發(fā)現為圓形或橢圓形、呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌，不形成芽胞。液體培養(yǎng)物呈輕微混濁，可見少量絮狀沉淀；均以短鏈為主，革蘭氏陽性，有時老齡培養(yǎng)物會出現陰性；在普通瓊脂上生長不良，可見針尖大小的S型菌落；在麥康凱瓊脂上不生長。

1.2.2 生化試驗 該菌可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇；吲哚試驗及觸酶試驗為陰性，MR、尿素分解酶試驗為陽性；三糖鐵試驗斜面產酸、穿刺產酸產氣、不產硫化氫（見表1）。

1.2.3 藥敏試驗 將菌液調至0.5個麥氏單位，取該菌液0.1 mL，均勻涂滿普通瓊脂平板，藥敏紙片按2000年美國NCCLS藥敏試驗法規(guī)制備，采用NCCLS法規(guī)（2000）判定標準進行判定，結果見表2。1.2.4 動物試驗 小鼠注射菌液后，可見其背毛逆立，精神沉郁，食欲減退；48 h內小白鼠全部死亡，剖檢均可見腦出血，肝、脾腫大，肝表面有針尖大小的出血點；對照組均正常。1日齡雛雞注射菌液后，雛雞死前癥狀表現為精神沉郁，食欲減退，走路不穩(wěn)，剖檢可見敗血癥變化；對照組正常。

從病死動物的心血中均可分離到接種菌。

1.2.5 結論 初步確定該病菌為鏈球菌科腸球菌屬（Enterococcus）成員。

表1 病原菌的生化反應結果

2 病原菌16S rRNA序列分析

2.1 材料與方法

2.1.1 試驗材料 來源于試驗1中分離出來的細菌。

2.1.2 引物 用擴增16S rRNA通用引物，由上海生工合成，引物基因序列見表3。引物稀釋時，加入滅菌 ddH2O 124 μL， 配成 100 μmol/L 母液 ；取20 μL 母液加入 ddH2O 180 μL， 稀釋至 200 μL，配成10 μmol/L使用濃度。

2.1.2 試驗方法

2.1.2.1 16S rDNA的提取 挑取鏡檢純凈菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，在無菌條件下取適量菌液于1.5 mL的EP管中，離心后棄去培養(yǎng)液 （盡量干凈），加入Lysing buffer 40 μL，放入水浴鍋中55℃、10 min及 80℃、10 min后， 再加入 ddH2O 80 μL，12 000 r/min離心10 min，取上清獲得模板DNA。

2.1.2.2 PCR擴增 使用16S rRNA基因的上下游引物（27F、92R）進行擴增。 反應總體積 50 μL，反應體系見表4。反應條件與步驟：95℃預變性5 min；94℃變性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸1 min30 s，循環(huán)29次；72℃、10 min。反應結束后PCR產物于4℃中儲存?zhèn)溆谩＝?05 V凝膠電泳20 min后，在紫外檢測儀下觀察結果。

表4 擴增反應體系

表2 藥敏試驗結果

表3 引物基因序列

2.1.2.3 PCR產物回收與純化 40 μL PCR產物樣品與 7 μL 6×loading buffer混合， 以 105 V 電泳20 min，結束后割下目的片斷，采用小量膠回收試劑盒回收。

2.1.2.4 序列分析 將純化的16S rDNA樣品進行序列測定，采用DNAstar等軟件對序列進行分析。2.2 結果

2.2.1 PCR產物電泳結果 16S rRNA PCR結果見圖1，圖中顯示約在1 500 bp處有一條明顯的電泳帶。

2.2.2 序列分析 應用BLAST程序，將所測序列進行分析，挑選代表種繪制進化樹，結果顯示所分離的菌株與Enterococcus faecium各菌株之間同源性最高，達99.3%。

圖1 PCR產物電泳結果圖

圖2 依據16S rRNA繪制的進化樹

3 討論與結論

根據本次試驗的各項結果，參照文獻[2]，確定分離到的細菌為糞腸球菌。

糞腸球菌為條件致病菌，它來源于人和溫血動物的糞便，偶爾出現于感染的尿道及急性心內膜炎病例。它能夠通過食品對人類造成感染，常見于許多食品如火腿腸、炸肉丸、布丁及經過巴氏消毒的牛乳等，糞腸球菌進入食物鏈的主要原因是由不衛(wèi)生的加工條件所致的，一般與直接的糞便感染無關。糞腸球菌引起的感染大多是由于它的侵襲所造成，感染劑量較高，一般大于107個細菌；人、禽感染率最高，亦見于豬、牛、馬、山羊、綿羊及兔。

在人醫(yī)上，該菌已經成為院內感染的第二大病原，但在動物醫(yī)學領域，對該病原的研究很少。開展腸球菌感染的研究，可以幫助人們提高對腸球菌感染的認識及警惕性[3]。

動物試驗表明，該菌有較強的致病性。對小白鼠、雛雞均敏感，且都能從其實質臟器和腦中分離到接種菌，并與接種菌有一致的培養(yǎng)、生化及溶血特性。

近年來，國內外報道腸球菌的耐藥性問題比較嚴重，其所致感染較難控制。本試驗分離菌除對慶大霉素、青霉素、氧氟沙星敏感外，對頭孢菌素類等6種藥物均表現為耐藥性，這一點應引起獸醫(yī)工作者的注意和重視。