不同純化濃縮方法制備的新城疫疫苗對SPF雞免疫效果的研究

陳靜怡 福州大北農生物技術有限公司 福州 350014

新城疫 （Newcastle Disease，ND），又叫亞洲雞瘟、偽雞瘟、禽副流感Ⅰ型（APM-1）。1926年首先發現于印度尼西亞的爪哇，不久又因在英國新城大面積暴發流行而被發現，因此命名為新城疫[1-2]，它是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染導致禽類發生高熱、全身性敗血癥，是危害養禽業的一種主要傳染病。

新城疫發病率高，經濟損失大，市場上新城疫的疫苗種類雖然很多，但免疫效果依然不理想。因此，對于新城疫疫苗免疫效果的提升有許多報道，有的認為需要制定合理的免疫程序，如王艷平[3]認為活疫苗與滅活疫苗需交替使用。而滅活苗的免疫主要是肌肉注射，在新城疫滅活疫苗生產過程中，由于收獲的尿囊液中混有少量的蛋殼、尿酸鹽、雜蛋白質（如卵黃等）、內毒素等，因此，在疫苗使用過程中質量難以穩定，被免疫雞時常會出現不良的免疫副反應。有一些雜質對疫苗產生免疫抗體還會有影響，而且嚴重影響單位劑量的免疫效果，嚴重時可導致免疫失敗。另外，抗原中過多的雜質使得抗原滅活過程消耗大量滅活劑甲醛，甲醛在雞體內殘留將影響人類食品安全。本試驗通過對比不同濃縮倍數對新城疫疫苗免疫效果的影響來確立最佳的濃縮倍數，為以后制備含新城疫病毒的二聯疫苗、三聯疫苗、四聯疫苗提供試驗依據。不僅對疫苗廠家的生產有積極的意義，且對雞群免疫、食品安全有更重要的意義。

1材 料

1.1 特異性血清及抗原 新城疫病毒 （La sota株）的標準特異性陽性血清由中國獸醫監察所提供。新城疫抗原為福州大北農生物技術有限公司自制。

1.2 試驗動物及其他 SPF雞胚：SPF蛋購自山東濟南斯帕法斯公司，由福州大北農生物技術有限公司孵化并飼養成所需日齡試驗用雞。

1.3 主要設備 青島依愛孵化器，Millipore超濾濃縮儀，10K聚醚砜超濾膜包，恒溫恒濕箱，單孔微量移液器，八孔微量移液器，振蕩器，96孔U型微量板，高速剪切機等。

2方 法

2.1 疫苗的制備

2.1.1 抗原的純化濃縮 將制備好的抗原使用高速管式分離機采用15 000 r/min、3 kg/min進行離心，離心后取樣500 mL標記為抗原h，其余的抗原用Millipore濃縮系統使用10K聚醚砜膜包進行濃縮，在濃縮進行到2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍時分別取樣 500 mL，標記為抗原 a、b、c、d、e、f。將制備好未經離心的抗原用Millipore濃縮系統使用10K聚醚砜膜包進行2倍濃縮，標記為抗原g。

2.1.2 抗原的滅活與乳化 將以上各組抗原按照規程要求，加入0.1%甲醛溶液，37℃滅活 16 h，同時按照規程要求對滅活后的抗原進行各項檢驗，標準應達到要求。將達到要求的抗原按照一定乳化比例（水相與油相比）進行乳化。抗原a～h經滅活乳化后分別標記為疫苗A～H。

2.2 以不同抗原制備成的滅活疫苗免疫SPF雞后抗體水平檢測及攻毒對比試驗

2.2.1 免疫試驗 試驗動物分組：選擇95羽由公司自行飼養的30日齡健康SPF雞，隨機分成9組，A～H每組10羽，每羽分別胸部肌肉接種20 μL疫苗A～H；I組5羽為空白對照，每羽胸部肌肉注射PBS 20 μL。 免 疫 后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、70 d、90 d分別采血檢測免疫組與對照組雞的平均抗體水平，同時觀察疫苗的吸收情況。

2.2.2 疫苗吸收情況 免疫后第7 d觀察每羽雞的疫苗吸收情況；免疫后第35 d每組剖檢2羽SPF雞，觀察疫苗注射部位情況；對照組剖檢1羽。

2.2.3 攻毒對比試驗 試驗動物分組：選擇95羽由公司自行飼養的30日齡健康SPF雞，免疫組每組10羽，I～VIII組分別免疫疫苗 A～H；空白對照組5羽，每羽胸部肌肉注射PBS 20 μL。在免疫后第28 d，免疫組和空白對照組每羽雞肌肉注射新城疫病毒強毒株北京株 0.5 mL（CVCCAV611株，含105.0ELD50）進行攻毒，注射后連續觀察14 d。注射強毒后SPF雞死亡的，為攻毒未保護；SPF雞未死亡的，為攻毒保護。

3 結果與分析

3.1 疫苗免疫后的吸收情況 免疫后第7 d和第35 d觀察疫苗的吸收情況，結果見表1。疫苗免疫后第7 d，9組的接種部位肉眼均可見有不同程度的疫苗未完全吸收現象，其中G組個別SPF雞在接種部位可見較嚴重紅腫，其他8組與對照組差異不顯著，注射部位附近均發現有少量出血點。

疫苗免疫后第 35 d，每組各剖檢2羽SPF雞進行觀察 （對照組剖檢1羽），G組疫苗沒有被完全吸收，注射部位附近有少量乳黃色黏稠狀液體，并有少量出血點，而其他8組未發現有肉眼可見的變化。

表1 疫苗的吸收情況

3.2 疫苗免疫后的抗體水平 疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、45 d、70 d、90 d 分別采血測HI抗體水平，結果見表2，并繪制出抗體水平變化曲線圖，見圖1。

表2 SPF蛋源試驗雞新城疫HI抗體水平

圖1 乳化后各組疫苗抗體水平的消漲曲線

3.3 疫苗免疫后的攻毒保護情況 攻毒試驗組在疫苗免疫后的第28 d，注射強毒進行攻毒，攻毒保護結果見表3。

表3 SPF蛋源試驗雞新城疫免疫攻毒保護情況

4討 論

由疫苗吸收試驗可以發現G組有較大的不良反應，這可能是因為G組疫苗沒有經過離心純化直接進行濃縮，在這過程中不僅抗原濃縮了，疫苗中的雜質如蛋殼、卵黃等也進行了濃縮，增加了疫苗中雜質的含量，因此出現了較大的不良反應，而進行了離心純化的疫苗組與對照組 （接種PBS）沒有明顯差異，可見經過離心純化后，疫苗內雜質明顯減少。

由疫苗免疫后的抗體水平試驗可以發現：未進行濃縮的H組，抗體水平較低，特別是在14～45 d，H組與其他組的抗體水平差異極顯著。

從濃縮倍數方面分析，當濃縮倍數越高時，抗體水平也越高，并且攻毒保護率可達9/10，而疫苗未經濃縮的其抗體水平相對較低。未經離心直接2倍濃縮的G組與經過離心后2倍濃縮的A組，在抗體水平表現上雖然差異不顯著，但是未經離心直接濃縮的由于雜質含量較多，所以在疫苗免疫后其吸收效果也較不理想。因此，如果只是為了提高抗原含量而只進行濃縮、未進行離心是不可取的，它將會影響疫苗的免疫效果。

從圖1可知，各組在第7～14 d，抗體均有一個成倍增長的過程，而第14～21 d，抗體的增長速度放緩，約第21 d達到最高水平，而在第21 d后抗體水平逐漸下降，下降速度緩慢。并且發現濃縮倍數越高，下降速度越慢，濃縮倍數低下降速度快。各組的抗體水平在免疫后第14 d均表現出顯著差異，這說明不同濃縮倍數對于抗體水平影響極大，這與王春華[4]的研究結果相一致。趙繼勛[5]認為新城疫抗體只要達到8log2及以上就可以抵抗野毒的感染，而本試驗中經過離心后的抗原經5倍以上濃縮，抗體水平最高，均可達到8log2以上。