基于適冷酶研究的生物綜合實驗教學設計

王全富， 侯艷華， 王一帆， 王亞彤

(哈爾濱工業大學威海校區 海洋科學與技術學院， 山東 威海 264209)

0 引 言

隨著現代生命科學的迅猛發展及生物科技產業化的突起，社會對生物工程人才需求量不斷增加，表明現代生物技術在我國經濟建設中的作用越來越受到重視。同時用人單位對生物工程本科畢業生，不僅要求具有較扎實的生物工程基礎理論知識，同時更強調具備較好的實驗技能以及在研發過程中發現問題和解決問題的綜合素質能力。生物工程專業的綜合性實驗是在該專業學生掌握一定基礎知識和基本操作實驗設備的技能基礎上，運用幾門相關重要的專業課程的綜合知識，對學生進行綜合訓練的一種復合式的實驗。現階段，很多高校也都對生物綜合性實驗的研究內容和方法進行了研究和探索，通過綜合實驗的改革創新，不斷提高了實驗的教學水平和質量，取得了較好的效果[1-5]。

高校生物工程專業，如何培養學生有特色、并更快、較早接觸學術前沿、實現科教融合，是亟需解決的問題。因此，本文針對我校生物工程海洋資源開發與利用辦學特點，對生物工程綜合性實驗教學進行了改革與實踐，提出以海洋微生物為材料，對其中適冷酶進行基因克隆、生物信息學和同源建模分析，以及基因表達與純化為綜合實驗，使學生深入了解海洋微生物適冷酶基因的科學研究技術和流程，挖掘學生的創新潛力，提升學生的實驗操作技能，進而達到提高實驗教學質量的目的。

1 綜合實驗的教學特色和目標

海洋資源的開發和利用已成為海洋大國競爭的焦點之一，其中海洋生物基因資源的研究和利用是熱點科學問題[6]。生物工程綜合實驗是基于海洋生物資源領域研究熱點和校區海洋特色培養重點，依托專業教師的最新科研成果，定位在生物化學、微生物實驗課的基礎上，結合生物信息學、基因工程、酶工程和海洋生物學所學基礎知識，構建多門課程的交叉綜合實驗課程(見圖1)。綜合實驗通過強調科學問題熱點引領，通過自主設計，對技術基礎和專業基礎實驗內容的改革、提升和創新，要求學生掌握海洋微生物適冷酶的科學研究技術和流程，提升學生的實驗操作技能，為學生在以后參加的科技活動和畢業設計奠定基礎。

圖1 生物綜合實驗所屬多課程的交叉

2 實驗內容

2.1 實驗菌株及目的基因的選擇

以海洋嗜冷菌Psychrobactersp. ANT206和Pseudoalteromonassp. ANT506為材料，根據學生興趣，自主選擇地適冷酶，如超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶、蛋白酶和谷氧還蛋白等6種適冷酶。

2.2 適冷酶基因克隆與生物信息學分析

利用PCR技術擴增目的基因全長序列，然后利用T-A克隆技術將該基因轉入宿主菌E.coliDH5α中[7]，測定相關適冷酶基因序列。根據在線軟件對適冷酶基因測序結果進行綜合分析，可以進一步得到目的基因及其所編碼蛋白質的生物學信息，具體內容包括：利用NCBI對適冷酶基因序列的開放閱讀框進行預測與分析[8]；利用ExPASy進行適冷酶基因序列的翻譯，并預測所編碼蛋白質的理化性質[9]；利用COILS進行卷曲螺旋預測；利用PSORT Server在線預測蛋白質的亞細胞定位；利用NetPhos 2.0 Server預測蛋白質潛在的磷酸化位點；利用Bioedit[10]及MEGA7.2[11]構建適冷酶基因序列系統進化樹。

2.3 適冷酶的同源建模和蛋白結構特征分析

同源建模分析選擇已報道的來源于中溫同源酶與本實驗的適冷酶進行結構比較[12-13]。利用PyMOL軟件比對兩組序列的三維結構，利用Protein Interactions Calculator program(http://pic.mbu.iisc.ernet.in)分析陽離子-π鍵相互作用、芳香環間的相互作用、離子間的相互作用、疏水相互作用、氫鍵等分子內作用力[14]，利用VMD1.9.3分析鹽橋數量[15]。

2.4 海洋生物功能基因的表達與純化

將目的基因與質粒pET-28a (+)連接，并將其轉入E.coliBL21中，篩選陽性重組菌，并通過低溫誘導培養的方法誘導目的基因的異源表達。利用Ni-NTA純化重組適冷蛋白，并經SDS-PAGE進行重組適冷酶的純度驗證。

2.5 重組適冷酶的活性研究

測定純化過程中蛋白質含量和重組酶活性，算出相應的比酶活和回收率等數值。在純化的基礎上，對重組適冷酶的最適溫度進行研究。

3 實施方案

依托于海洋生物基因資源的研究和利用的熱點科學問題，建立一套立體式的海洋微生物適冷酶基因研究生物工程綜合實驗課。具體實施方案如圖2所示。

3.1 實驗理論學習

(1) 介紹綜合實驗課程的教學目標及主要內容，布置學生自主查閱6種適冷酶的相關文獻，在閱讀相關文獻后，撰寫文獻總結報告，根據學生興趣，提出擬開展的創新性實驗設計和方案。

(2) 教師根據學生提交的文字材料，并根據學生意向進行分組，開始實驗。

3.2 實驗安排

(1) 綜合實驗為4周學時，具體分配，基因克隆與生物信息學(1周)，基因表達與重組蛋白純化(2周)，電泳檢測和蛋白活性分析(1周)。

圖2 生物工程綜合實驗的實施方案

(2) 在各組實驗教師的指導下，進一步完善每組的實驗方案，同時熟悉實驗所使用的設備以及所采用方法的原理，回顧相關課程教學知識，然后開始實驗研究，在實驗的同時進行數據分析。

(3) 學生參加“開放式、研究性”實驗交流會。圖3所示是利用同源建模方法，構建適冷酶與同源中溫酶三維結構比對模型圖。圖4所示是實驗交流會上適冷酶的表達與純化結果。從圖4(a)結果看出，學生能把適冷酶的基因表達出來，但是沒有純化出來。經過學生查閱文獻和組里老師討論，通過降低包涵體尿素處理濃度和改變Ni-NTA親和層析的條件，最終將目標蛋白純化出來[見圖4(b)]。

圖3 適冷酶與同源中溫酶三維結構比對模型圖

因此，學生完成上述基因生物信息學分析，以及表達和純化后，各組教師召開討論組，結合各組的實驗結果引導學生依次思考如下問題：① 自己所克隆的基因表達情況如何？② 適冷酶的同源建模過程中，同源模型序列選擇依據是什么？③ 適冷酶的分子結構特點有哪些？④ 電泳條帶出現條帶歪曲，如何改進?⑤ 表達后蛋白純化效果和活性如何?學生運用學到的知識結合教師提示和自己的實驗操作等環節解決問題，最后撰寫一篇科技論文格式的研究報告。

(a) 第一實驗結果(b) 改進后實驗結果

圖4 適冷酶的表達與純化的結果

3.3 考核方式

實驗完成后每人撰寫相關的研究報告，并按照實驗小組進行答辯。考核成績中，實驗動手能力占60%，研究報告撰寫占20%，實驗結果答辯占20%。

4 結 語

經過一系列的創新探索和實踐后的“基于適冷酶研究的生物綜合實驗”課程，更加彰顯了以學生獨立實施的主題，提高學生對實驗的積極性，增強學生獨立分析解決問題的能力，加強學生團隊合作意識，培養學生科研能力，從而提升大學生參與科技活動的積極性。通過生物綜合實驗系統學習了生物信息學和分子生物學等實驗技術，本科生以第一作者在Microbiological Research等國際SCI學術期刊發表了論文[16]，獲得第十三屆“挑戰杯”全國三等獎。但生物綜合實驗方案還存在一些問題，實驗教學內容和方法還需要不斷完善。