溫度對大口黑鱸幼魚不同組織抗氧化能力及免疫相關蛋白表達的影響

孫永旭,董宏標,王文豪,曹明,段亞飛,李華,劉青松,張家松,4,*

1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室,廣州 510300

2.上海海洋大學水產與生命學院,上海 201306

3.廣東省漁業種質保護中心,廣州 511453

4.中國水產科學研究院南海水產研究所深圳試驗基地,深圳 518121

0 前言

大口黑鱸(Micropterus salmoides)屬于鱸形目(Perciformes)、太陽魚科(Centrarchidae)、黑鱸屬(Micropterus),又稱加州鱸,因其生長速度快、抗逆性強、市場潛力大等優點,已在廣東、江蘇、浙江等地大規模養殖,成為中國南方地區淡水人工養殖的主養高檔品種之一[1]。據統計,2016年我國大口黑鱸養殖產量達37 萬噸[2]。而在魚類生長發育過程中,幼魚階段正值其免疫力薄弱、組織器官發育及增產增重的關鍵時期,過度的環境應激不僅會導致魚類免疫力下降,生長速度減慢,甚至會造成魚類死亡。

在自然界中,季節更替[3]、洋流運動[4]、及全球變暖效應[5]等均會導致水體溫度的改變。溫度是影響魚類生長發育的重要環境因素之一,在魚類生長、繁殖、新陳代謝及滲透調節等方面均有顯著影響[6]。生物對不同生態因子都有一個由最高耐受點和最低耐受點構成的耐受范圍,這個范圍被稱為生態幅[7]。當外界溫度處于魚類溫度生態幅之外時,將對魚體造成脅迫,使得機體氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)代謝紊亂,并在組織器官內大量積累,過多的ROS 會攻擊生物膜,生成脂質過氧化物(lipid peroxidation,LPO),并最終分解為丙二醛(malondialdehyde,MDA)[8]。谷胱甘肽(glutathione,GSH)一方面作為抗氧化酶(GPX)的底物來清除過多的ROS,另一方面可直接和部分ROS反應,參與ROS的代謝過程[9]。此外,ROS 的積累常常還伴隨著機體免疫防御機制的紊亂[10]。熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)和金屬硫蛋白(metallothionein,MT)廣泛存在于人體、動植物和微生物體內,在機體應激時大量合成,是機體應激時大量合成的保護蛋白[11-12]。因此,機體應激脅迫常常表現出抗氧化酶和免疫相關蛋白等指標的變化[13-14]。如Madeira 等[11]研究發現,高溫脅迫誘導多種水生動物熱休克蛋白70(HSP70)的表達;低溫脅迫使得黃姑魚(Nibea albiflora)抗氧化酶活性和HSP70 蛋白含量顯著升高[15];高溫脅迫同樣誘導金魚抗氧化酶活性的升高[16]。目前,國內外關于急性溫度脅迫對草魚[17],銀鯧[18]等魚類生理機能的影響已見相關報道,而關于長期馴養溫度對魚類生理機能的影響研究較少。本實驗探究了大口黑鱸幼魚在不同馴養溫度下肌肉、肝臟、鰓和腸道組織中抗氧化能力及免疫相關蛋白的變化,以期為研究大口黑鱸幼魚對環境溫度的適應機制和健康養殖提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大口黑鱸幼魚購自廣東省珠海市白蕉鎮某養殖場,先在室內圓形養殖池中(直徑:4.5 m,高0.8 m)暫養2 周。暫養期間每天08:00 飽食投喂一次(海皇鱸魚專用配合飼料),并及時撈出殘餌。每天16:00 底部吸污排水,換水量為15%左右。暫養期間養殖用水為曝氣24 h 后的自來水,水溫(29±1) ℃,pH 7.5±0.2,溶氧≥6.0 mg·L-1,自然光周期。

1.2 實驗設計

暫養結束后隨機選取規格相近、體表無傷的大口黑鱸幼魚72 尾,體質量均值為(110±5) g。實驗設置21 ℃、25 ℃、29 ℃和33 4℃ 個溫度梯度組,每組3 個重復,每個重復6 尾。實驗魚養殖于100L 圓形PVC 養殖桶,室溫(29±0.5) ℃穩定3 d 后,用冷水機(中國,海利HC-150A)和自動控溫加熱系統(中國,威諾WN-15E)以1 ℃·d-1的速率將各組溫度降/升溫到預定溫度,并保持不變,實驗周期為2 周[13-14]。日常換水之前將曝氣后的自來水預冷或預熱到與養殖桶水溫一致。養殖實驗期間其他日常管理同暫養期間一致。

1.3 樣品采集與分析

取樣前24 h 停止喂食。于每個實驗組隨機抽取6 尾,200 mg·L-1MS-222 迅速麻醉,冰盤上解剖,取其肌肉、肝臟、鰓和腸道組織,在預冷的生理鹽水中漂洗后,濾紙拭干,放入提前標記好的1.5 mL 無菌離心管中,-80 ℃冰箱保存。

樣品測定前在4 ℃冰箱中解凍,用預冷的生理鹽水洗滌,濾紙吸去表面水分,稱重后按照質量體積比加入9 倍預冷生理鹽水,冰水浴中均質機勻漿,勻漿液經低溫離心(4 ℃,3500 r·min-1,10 min)后,取上清液于預冷的無菌離心管中,-20 ℃保存。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、微量還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)和金屬硫蛋白(metallothionein,MT)均采用試劑盒法(購自南京建成生物工程研究所)測定,并進行結果分析。

組織中每毫克蛋白在0.24 mL 反應液中,抑制率達50%時所對應的酶量定為一個SOD 活力單位(U)。組織中每毫克蛋白在每秒鐘分解1 μmol 的H2O2的量為一個CAT 活力單位(U)。MDA 含量測定采用TBA 法。GSH 測定采用微量酶標法。T-AOC測定采用FRAP 法。HSP70 和MT 均采用干粉法測定。總蛋白測定采用考馬斯亮藍法。

1.4 數據處理分析

應用SPSS 20.0 和origin 9.0 軟件進行統計分析和作圖。采用單因素方差分析(one-way ANOVA),LSD 多重比較檢驗,P＜0.05 為顯著水平,結果用平均值±標準誤差(Mean±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 溫度對大口黑鱸幼魚抗氧化能力的影響

2.1.1 溫度對大口黑鱸幼魚SOD 活性的影響

如圖1所示,在同一溫度組中,各組織中SOD活性存在較大差異,由高到低分別為鰓、腸、肝臟和肌肉。不同溫度組之間,實驗魚肌肉中SOD 活性在25 ℃時最低但與其他組差異不顯著(P＞0.05)。肝臟中SOD 活性隨溫度升高而先降低后升高,29 ℃和25 ℃組顯著(P＜0.05)低于21 ℃和33 ℃組。鰓和腸組織中SOD 活性同樣隨溫度升高呈倒拋物線趨勢,在29℃組中其活性顯著低于其他三組(P＜0.05)。

2.1.2 溫度對大口黑鱸幼魚CAT 活性的影響

如圖2所示。在同一溫度組中,肌肉和腸中CAT活性較低,而肝臟和鰓中CAT 活性較高。不同溫度組之間,實驗魚肌肉中CAT 活性隨著溫度升高而變化,在25 ℃時最低,但與其他組相比,差異不顯著(P＞0.05)。肝臟中CAT 活性隨溫度升高同樣呈現波動性,在水溫為29 ℃時最低,且顯著低于其他溫度組。鰓和腸組織中CAT 活性隨溫度升高而呈現先降低后升高的趨勢,分別在29 ℃和25 ℃時達到最低,其中,29 ℃組鰓中CAT 活性顯著(P＜0.05)低于其他三個溫度組,25 ℃組腸組織中CAT 活性與29 ℃組差異不顯著(P＞0.05),但與低溫組(21 )℃和高溫組(33 )℃差異顯著(P＜0.05)。

2.1.3 溫度對大口黑鱸幼魚MDA 含量的影響

如圖3所示:同一溫度組中,組織中MDA 含量由高到低分別為鰓、腸、肌肉和肝臟。不同溫度組間,肌肉和腸組織中MDA 含量隨溫度升高呈波動性變化,最高出現在21 ℃組,且顯著高于其他溫度組(P＜0.05)。 肝臟中MDA 含量在21 ℃組反而最低,顯著低于25 ℃和33 ℃組(P＜0.05)。四個溫度組實驗魚的鰓組織中MDA 含量較高但差異不顯著(P＞ 0.05)。

2.1.4 溫度對大口黑鱸幼魚GSH 含量的影響

如圖4所示:同一溫度組中,肌肉中GSH 含量較低,肝臟、鰓和腸組織中GSH 含量較高。不同溫度組間,肌肉和腸組織中GSH 顯著低于其他組(P＜0.05)。肝臟中GSH 含量隨溫度變化而波動,在29 ℃組最低,33 ℃組最高。鰓和腸組織中GSH 含量隨溫度升高而先降低后升高,分別在25 ℃和29 ℃組最低,但兩組之間差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 溫度對MDA 含量的影響 Figure3 Effects of temperature on MDA content

圖4 溫度對GSH 含量的影響 Figure4 Effects of temperature on CAT content

2.1.5 溫度對大口黑鱸幼魚T-AOC 的影響

如圖5所示,同一溫度組中,各組織中T-AOC存在差異,肌肉組織中T-AOC 最低,肝臟組織中最高。不同溫度組間,肌肉中T-AOC 隨著溫度升高而先降低后升高,最低出現在29 ℃組,顯著(P＜0.05)低于其他溫度組。肝臟中T-AOC 隨溫度升高而上下波動,同樣在29 ℃最低,與21 ℃和33 ℃組之間差異不顯著(P＞0.05)。鰓組織中T-AOC 隨溫度升高變化不大。腸組織中T-AOC 隨溫度升高而呈先降低后升高的趨勢,在25 ℃組最低,與29 ℃組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 溫度對大口黑鱸幼魚免疫相關蛋白表達含量的影響

2.2.1 溫度對大口黑鱸幼魚HSP70 表達的影響

如圖6所示,同一溫度組中,肌肉組織中HSP70 含量較高,鰓中較低。不同溫度組間,肌肉中HSP70 含量隨著溫度升高呈逐漸升高的趨勢,最低出現在21 ℃組,且該組顯著低于(P＜0.05)其他溫度組。肝臟中HSP70 含量隨溫度升高而先升高后降低,在29 ℃組最高,但與其他三組之間差異不顯著(P＞0.05)。鰓組織中HSP70 含量隨溫度升高變化不大,在33 ℃組最高。腸組織中T-AOC 隨溫度升高而呈先升高后降低的趨勢,在25 ℃組最高,21 ℃組最低,兩組間差異顯著(P＜0.05)。

2.2.2 溫度對大口黑鱸幼魚MT 表達的影響

圖5 溫度對T-AOC 的影響 Figure5 Effects of temperature on T-AOC

圖6 溫度對HSP70 含量的影響 Figure6 Effects of temperature on HSP70 content

圖7 溫度對MT 含量的影響 Figure7 Effects of temperature on MT content

如圖7所示,同一溫度組中,肝臟中MT 含量較高,鰓中含量較低。不同溫度組間,肌肉和肝臟中MT含量隨著溫度升高呈先升高后降低的趨勢,最高出 現在29 ℃組,但各組之間差異不顯著(P＞0.05)。鰓和腸組織中MT 含量隨溫度升高呈現波動性變化,最高均出現在33 ℃組,且與其他三組之間差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

3.1 溫度對大口黑鱸幼魚不同組織抗氧化能力的影響

溫度是影響魚類生長發育的重要環境因素之一。不適的溫度會引起魚體的應激反應,而應激反應常常與ROS 的過量積累有關[21]。正常情況下,機體ROS 的產生與分解處于動態平衡中;但當受到外界脅迫刺激時,這種動態平衡即被打破,ROS 迅速積累,當其積累超過魚體承受范圍時會導致機體的氧化應激損傷[22],引起組織器官結構與功能上的變化,進而體現為抗病能力、生長速率等生產指標的降低。如長期低氧應激下,黃顙魚對嗜水氣單胞菌的抗病力顯著下降[23]。高密度應激下,魚類的能量輸送偏向于生理功能調節,進而降低了生長速率[24]。生物體在長期進化過程中形成了一套完整的抗氧化系統來清除過多的ROS,避免一定程度上的氧化應激損傷,這套系統分為酶類抗氧化劑(SOD 和CAT 等)和非酶類抗氧化劑(GSH 和維生素C 等)[25-26]。研究表明,SOD 主要作用是將生物自身代謝或外界脅迫下產生的ROS轉化為過氧化氫,而CAT作為過氧化氫的清除劑,將過氧化氫還原成氧分子和水[27]。

由于生物抗氧化系統的響應機制因物種、組織器官等而異,因此,隨著溫度變化,其抗氧化酶活性也呈現不同的變化趨勢。由最適溫度開始,軍曹魚(Rachycentron canadum)[28]和吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)幼魚[29]SOD 和CAT 活性隨溫度降低而升高;褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[30]、小黃魚(Larimichthys polyactis)[31]和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[32]SOD 活性隨溫度升高而降低;金魚(Carassius auratus)[33]SOD 活性高溫脅迫溫度升高而升高,并且肝臟和腎臟中SOD 活性較高。在本實驗中,不同溫度對大口黑鱸幼魚造成的脅迫效應不盡相同。整體而言,隨著溫度從21 ℃到33 ℃上升,大口黑鱸幼魚肝臟、鰓和腸道中SOD 和CAT活性隨溫度上升而呈先降低后升高的趨勢,且基本均在29 ℃時活性最低。研究指出,大口黑鱸最佳生長水溫為28.1—28.6 ℃[34],這與本實驗研究結果相似。其抗氧化酶活性變化趨勢與軍曹魚[28]、吉富羅非魚[29]和金魚[33]等研究類似,推測在低溫或高溫脅迫下,大口黑鱸幼魚體內自由基代謝平衡被打破使得ROS 積累,進而誘導抗氧化酶活性的增強。而在比較低溫和高溫脅迫應激發現,25 ℃溫度組中SOD活性較為接近適溫組,而在33 ℃組中SOD 呈較高活性,表明相較于低溫脅迫,高溫對大口黑鱸幼魚機體造成了更大損傷。高溫會降低水體溶氧[35],加速機體代謝[36-37],代謝和呼吸旺盛加劇水體溶氧消化和水質惡化,間接影響魚體脅迫,進而導致在本實驗中,高溫表現出對實驗魚具有較高的氧化應激損傷影響。在對不同組織中SOD 和CAT 活性進行比較發現,四個組織中抗氧化酶活性存在較大差異:鰓,腸和肝臟中其酶活性較高且波動較大,而肌肉中較低且波動平穩。這表明長期溫度脅迫下,實驗魚鰓、腸和肝臟組織是主要響應靶器官,也是機體ROS 積累與代謝的主要場所。

當機體因外界脅迫積累大量ROS而無法及時清除時,過多的ROS 會攻擊生物膜,生成脂質過氧化物(LPO),并最終分解為MDA[8]。MDA 可改變生物膜流通性,對其造成損傷。因此,組織中的MDA 水平往往是機體脂質過氧化程度的體現,其側面反映了細胞損傷的程度[38]。而GSH 一方面作為抗氧化酶(GPX)的底物來清除多余的ROS,另一方面可以直接和部分ROS 反應,參與ROS 的代謝過程[9],其含量的多少與機體抗氧化能力密切相關。該實驗結果顯示,長期溫度脅迫下大口黑鱸幼魚鰓和腸中積累了大量MDA 和GSH,而肌肉中含量較低,這與SOD 和CAT 活性在肌肉中較低有一定一致性,推測溫度脅迫對實驗魚肌肉組織的影響較小。整體來看,升溫或降溫均對大口黑鱸幼魚組織器官產生一定氧化脅迫損傷。在相同的溫度應激程度(4 )℃下比較,25 ℃組中MDA 含量整體低于33 ℃組。這與南方鲇(Silurus meridionalis)幼魚[39]和虹鱒(Salmo gairdneri)[40]的研究結果相反,推測升溫或降溫的脅迫效應因魚種而異。本實驗表明大口黑鱸對升溫具有更高的敏感性,在長期高溫應激脅迫時,機體損傷程度更大。

T-AOC 是反映機體抗氧化能力的綜合指標。研究表明,魚體抗氧化能力與水溫之間有較高的相關性[41]。本實驗結果顯示,隨著溫度升高,大口黑鱸幼魚肌肉和腸組織中T-AOC 呈先降低后升高的趨勢,在21 ℃和33 ℃時最高,表明長期溫度脅迫影響,對機體造成了一定程度的氧化應激損傷,進而表現為T-AOC 的升高。在肝組織中,T-AOC 在一般低溫組(25 )℃最高,顯著高于(P＞0.05)其他三組,推測適度的溫度脅迫誘導抗氧化酶活性的增強,但過度的溫度脅迫對肝臟造成了一定不可逆損傷,抑制了機體免疫相關酶的活性,進而表現為T-AOC 的降低。

3.2 溫度對大口黑鱸幼魚不同組織免疫相關蛋白含量的影響

魚類為變溫動物,外界溫度變化會影響魚類在分子和生理方面的變化,熱休克蛋白(HSPs)作為機體應激時大量合成的內源性保護蛋白,其表達量常與抗氧化酶(SOD、CAT 等)一起作為衡量機體應激程度的指標[11]。已有研究指出,低溫脅迫誘導了黃姑魚(Nibea albiflora)[42]、東方藍鰭鮪(Thunnus orientalis)[43]和金槍魚(Salmo salar)[44]等HSP70 蛋白的表達。在本實驗中,與常溫組(29 )℃相比,其他溫度組HSP70 含量在肝臟和腸組織中反而有所降低,這與上述多數研究結果不符,可能因為急性脅迫誘導HSP70 蛋白合成以提高機體耐受性,但機體對長期溫度脅迫具有適應過程,如長期熱應激脅迫對鯉魚鰓組織中HSP70 的誘導效應不明顯,而急性脅迫可誘導該組織中HSP70 的大量表達[45]。HSP70 的表達同樣具有一定的時序性,研究發現隨著脅迫時間的延長,其含量呈先升高后降低的趨勢[42,46],并推測機體在受到脅迫刺激后建立了新的平衡。此外,Delaney 等[47]研究表明,中等強度增溫可顯著誘導鯉魚血清中HSP70表達,而高強度熱脅迫下,HSP70表達反而低于正常水平,這可能是因為機體對無法抵抗過高程度應激所造成的脅迫損傷,進而表現為免疫相關蛋白表達水平的降低。因此,本實驗中長期脅迫下各個溫度組中HSP70 表達量的降低很可能是這方面的原因導致,而較低的HSP70 表達量是否表明機體對后續可能的應激抵御力降低,并在一定程度上表現為機體自身免疫力的降低,還需要進一步的研究。

MT 是一類金屬結合蛋白,廣泛存在于人體、動植物和微生物體內,同樣在機體受到脅迫應激時大量合成[12]。研究發現,脅迫應激會導致MT 在魚類中顯示組織特異性的應答機制[48]。本實驗同樣發現不同組織中MT 的含量呈現組織差異性:肌肉和肝臟中MT 含量整體較高,而鰓和腸中MT 含量整體較低。不同溫度組之間MT 含量差異不大,僅在高溫組(33 )℃時,其MT 含量整體較其他組有較大差異,并且各個溫度組之間肝臟中MT 含量差異不顯著(P＞0.05)。該實驗結果與Silvestre[49]和周彥峰[50]等的研究相符,在脅迫時間持續增加以后,MT 含量由一開始的升高轉而降低,表明實驗魚對長期脅迫具有一定的適應性過程,以抵抗應激對機體所造成的損傷。

4 結論

本研究初步表明,長期溫度脅迫對大口黑鱸肝臟、鰓、腸和肌肉均造成一定應激損傷,其中鰓、腸和肝臟組織是主要響應靶器官,也是機體ROS 積累與代謝的主要場所。升溫或降溫均對大口黑鱸幼魚組織器官產生一定氧化脅迫損傷。大口黑鱸對升溫具有更高的敏感性,相較于低溫脅迫,高溫對大口黑鱸幼魚機體造成了更大損傷。而大口黑鱸魚對長期脅迫具有一定的適應性過程,以抵抗應激對機體所造成的損傷。