三叉神經節遞質的UHPLC-MS/MS法測定

付曉蕓　唐雪　李星影　畢祿莎　孫嘉茵　徐小平

摘要：該文采用UHPLC-MS/MS建立一種同時測定大鼠三叉神經節中4種神經遞質的方法。SD大鼠三叉神經節組織勻漿后，加乙腈沉淀蛋白，制備成供試品溶液;以Discovery HS F5-3（2.1mm×150mm，3.0μm）為色譜柱，0.1%甲酸溶液（A相）和0.1%甲酸-40%乙腈溶液（B相）為流動相，梯度洗脫進行分離;然后在+ESI和MRM模式下檢測，以 Glycine-N¹⁵為內標。結果表明：4種氨基酸的線性關系良好（r²≥0.999），檢測限和定量限分別為0.14～1.23ng/mL和0.47～4.11ng/mL;在濃度范圍內，進樣精密度、日內和日間精密度良好，RSD分別在0.90%～5.17%，3.01%～7.19%，4.64%～14.49%;加樣回收率為94.8%～108%。大鼠三叉神經節炎癥模型在0，1，3，5，7d4種神經遞質的含量均發生不同程度的變化，其中天門冬氨酸（Asp）在炎癥期沒有明顯的變化（P>0.05），而其余3種遞質變化顯著（P<0.05），且谷氨酸（Glu）最明顯，體外實驗也證實Glu在炎癥條件下含量增加。所建方法可高效同時分離檢測三叉神經中4種氨基酸的含量，有較好的使用價值。

關鍵詞：氨基酸類神經遞質;三叉神經;超高效液相色譜;三重四極桿質譜

中圖分類號：O657.63 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）01-0064-06

0 引言

生活中常說的“臉痛”即三叉神經痛（trigeminalnerve pain，TN），是一種反復發作在面部三叉神經分布區內的陣發性劇烈神經痛，是中樞系統常見病之一[1-21。中樞神經系統內廣泛分布大量的氨基酸，這類物質具有獨特的神經遞質作用，主要包括興奮性氨基酸[3]如谷氨酸[4]天冬氨酸和抑制性氨基酸Y-氨基丁酸[5]、牛磺酸等兩大類，當面部出現疼痛時，這些神經遞質亦會發生相應變化。三叉神經節神經元（trigeminal ganglion neurons，TGNs）是假單極神經元，其胞體位于三叉神經節，由大量衛星膠質細胞（satellite glia cells，SGCs）包裹。研究表明，口腔領面部的創傷、炎癥等刺激因素可以通過軸突運輸的途徑影響三叉神經節內TGNs-SGCs的交互對話，Glu是參與TGNs-SGCs交互對話的重要信號分子;所以，建立谷氨酸等神經遞質的檢測方法可為三叉神經疼痛機理的研究提供學術基礎。國內外對氨基酸分析測定方法有不少報道，主要有分光光度法[6]、柱前柱后衍生高效液相色譜（HPLC）法[7]、氨基酸分析儀法[8]、離子色譜法[9]、液質聯用法[10-11]、超高效液相色譜[12]等，但是針對三叉神經內氨基酸類神經遞質的同時檢測尚未見發表。由于神經節小，含量低且干擾多[13-14]，本文擬采用UHPLC-MS/MS法快速定量大鼠三叉神經組織內以及TGNs-SGCs共培養體系內4種氨基酸類神經遞質在疼痛前后的含量變化，通過對比炎癥組與空白對照組的氨基酸神經遞質的含量差異，可為三叉神經支配區域內疼痛異常提供神經遞質的定量變化基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津超高效液相色譜儀LC-30A與三重四極桿質譜儀LCMS-8050聯用系統：MTN-2008D氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）;KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;R201B旋轉蒸發儀（上海申勝生物技術有限公司）;HL104和XS205電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）：MaxiMix Ⅱ渦旋振蕩器（賽默飛世爾科技有限公司）;Milli-Q純水儀（美國Milli-Q公司）。

甘氨酸（Gly）對照品，谷氨酸（Glu）對照品，Y-氨基丁酸（GAGA）對照品，天門冬氨酸（Asp）對照品（中國食品藥品檢定研究院）;Glycine-N"（98%，Sigma-Aldrich）;乙腈、甲醇（色譜級，賽默飛世爾科技有限公司）;乙醇、甲醇（分析純，成都科隆化學品有限公司）;乙酸銨（色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）;甲酸（98%，LC-MS專用，百靈威科技有限公司）;甲酸（分析純，程度科龍化工試劑廠）：Matrigel basement membrane matrix（BD生物科技，美國）：木瓜蛋白酶（Sigma，美國）：Neurobasal-A培養基（Gibco，美國）。

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液的配置

分別取Gly，GABA，Asp，Glu對照品適量，配制成質量濃度為0.1mg/mL標準儲備液，用超純水逐級稀釋至10，20，50，100，200，500，1000，2000，4000ng/mL，即為標準溶液。

1.2.2 內標溶液的配制

取Glycine-N¹⁵適量，精密稱定，超純水配制成質量濃度20μg/mL的內標溶液。

1.2.3 樣品處理方法

取三叉神經節組織稱重，置于勻漿管中，精密加入生理鹽水1mL，勻漿后，吸取大鼠三叉神經組織勻漿液100μL，加入20μL內標工作液，再加入880μL乙腈，渦旋1min，14000r/min離心10min，取上清液20μL，進樣LC-MS-MS，記錄色譜圖和質譜圖，以質譜峰面積進行計算。

1.3 色譜條件的考察

實驗通過單因素考察，對色譜柱、流動相的比例、有機溶媒的極性和緩沖鹽的強度等進行篩選。

1.3.1 色譜柱的選擇

流動相均以0.1%甲酸（FA）作為水相，含有0.1%FA的乙腈或甲醇為有機相，流量0.2mL/min，以樣品中主成分峰的保留時間（t_R）、柱效（N）、拖尾因子（T）作為指標分別對色譜柱1^#：HILIC柱（SepaxPolar-Silica，4.5mm×150mm，3μm）：色譜柱2^#：五氟苯基柱（Ultimate PFP，2.1mm×50mm，3μm）;色譜柱3^#：五氟苯基柱（Discovery HS F5-3，2.1mm×150mm，3.0μm）進行考察。

1.3.2 有機相的選擇

選擇1.3.1獲得的最佳色譜柱，以0.1%甲酸（FA）作為水相，樣品中以4個氨基酸峰祎t_R、N、T作為指標考察乙腈和甲醇對分離過程的影響。

1.3.3 緩沖鹽濃度的選擇

選擇1.3.1獲得的最佳色譜柱，以0.1%甲酸（FA）作為水相，1.3.2項下最優的有機相，考察了0.1%FA溶液中添加不同濃度乙酸銨的影響。

1.4 色譜條件

色譜柱：Discovery HS F5-3，2.1mm×150mm，3.0μm;流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為0.1%甲酸-40%乙腈溶液;流量：0.20mL/min;進樣體積：2μL;柱溫：40℃;混合器體積：180μL;洗脫方式：梯度洗脫，如表1所示。

1.5 質譜條件

采用+ESI離子化模式和多反應監測（MRM）掃描模式;碰撞氣：氬氣，270kPa;接口溫度：300℃;DL溫度：250℃;加熱模塊溫度：400℃;接口電壓：4.0kV;參數見表2。

2 方法學驗證

2.1 線性關系、檢出限和定量限

取1.2.1中的標準溶液100μL，加內標液制成質量濃度為1，2，5，10，20，50，100，200，400ng/mL的標準曲線溶液，經測定計算各自線性方程，并經不斷稀釋檢測出儀器的檢出限（S/N≥3）和定量限（S/N≥10）結果。

2.2 精密度和準確度

以高中低3個濃度的AA混合標準溶液連續6次進樣;以制備的高中低3組供試品溶液在同一日反復檢測6次，于不同日測定，分別計算進樣精密度、日內和日間精密度。精密量取大鼠三叉神經組織勻漿液80μL，離心管，加內標液20μL，加標準溶液20μL，然后照1.2.3項下處理，制備高中低3個濃度的加標樣品，按照1.4和1.5項下條件分析，測定加樣回收率。

3 神經遞質的檢測

3.1 動物模型的選擇

以常見SD大鼠作為疼痛實驗模型[15-16];體重：160～180g。

3.2 三叉神經節中神經遞質的檢測

實驗設計了炎癥0，1，3，5，7d的大鼠模型，動物在全麻條件下取出三叉神經，每組8份樣品，組織樣品照1.2.3方法制備，照1.4和1.5項下測定條件檢測。并使用SPSS軟件進行配對樣本T檢驗，以判斷炎癥Od與炎癥1，3，5，7d數據是否具有統計學意義上的顯著差異。

3.3 TGNs-SGCs細胞培養基中神經遞質的檢測

本文利用TGNs-SGCs共培養體系，體外模擬驗證Glu在炎癥條件下的代謝變化。實驗中取新鮮獲取的三叉神經節，經木瓜蛋白酶溶液處理后加入Neurobasal-A培養基2mL重懸混勻。用Matrigel接種細胞懸液。置于37℃、5% CO₂的細胞培養箱中繼續培養24～48h獲得供試培養液。取供試培養液少許，照1.4，1.5項檢測不同培養時間，培養液中Glu的含量變化。

4 結果討論

4.1 液相色譜條件的選擇

色譜柱的選擇由表3可知，在相應的較優的流動相條件下，五氟苯基柱（Discovery HS F5-3，2.1mm×150mm，3.0μm）得到的評價指標更優，柱效更高，峰形對稱度更好，更適合后續進行條件篩選。有機相的選擇由表4可知，含40%的乙腈作為有機相，出峰情況好，柱效高。由表5可知，隨著緩沖鹽濃度的增加，離子強度上升，4種氨基酸的保留時間都隨離子強度增大而減小，加入緩沖鹽后對各種氨基酸的各項評價指標沒有明顯提升，故采用不加入緩沖鹽的0.1%FA作為水相。

4.2 標準樣品一級質譜圖和二級質譜圖

由1.5的質譜條件獲得氨基酸各自相應的總離子流圖，如圖l所示。

4.3 方法學驗證

由表6，表7可知，四種氨基酸在濃度范圍內的線性關系良好（r²≥0.999），檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.14～1.23ng/mL和0.47～4.11ng/mL。比傳統的氨基酸測定方法[17-18]的檢測限、定量限更低，說明本實驗采用的方法更靈敏高效。高中低3個不同濃度進樣精密度、日內和日間精密度的RSD分別在0.90%～5.17%，3.01%～7.19%，4.64%～14.49%：加樣回收率為94.8%～108%之間。

4.4 神經遞質的檢測

三叉神經節中神經遞質的檢測，由表8可知，4種氨基酸神經遞質中天門冬氨酸（Asp）炎癥模型中沒有明顯的變化（P>0.05），其余3種神經遞質在炎癥的1d未表現出明顯的變化外，在炎癥3，5，7d均表現出的顯著變化（P<0.05）。由圖2可知，疼痛過程中谷氨酸（Glu）的濃度在3d后明顯增高。甘氨酸（Gly）、γ-氨基丁酸（GAGA）的濃度略有增加。TGNs-SGCs細胞培養基中神經遞質的檢測結果如圖3所示。可知，在炎癥條件下神經元體外培養48h后，實驗組的Glu含量明顯高于空白對照組，與三叉神經疼痛趨勢和節中神經遞質的表現趨勢相同。

5 結束語

本文采用UHPLC-MS/MS法首次同時分離檢測三叉神經節中4種氨基酸的含量。采用優化后的色譜條件，檢測得到三叉神經節內Asp炎癥Od與炎癥1，3，5，7d沒有統計學意義上的顯著差異。Glu的濃度在炎癥刺激3d后明顯增高，體外實驗同樣證實了Glu在炎癥條件下的代謝變化。說明Glu的含量與疼痛異常行為密切相關，與炎癥變化進展相符[19]，另有研究發現中風、腦組織損傷、癲痛、帕金森病等病理過程突觸間隙Glu含量都增高[20-21]。此外，Gly、GABA的濃度略有增加，說明兩者作為抑制性的神經遞質，在炎癥下釋放增加，抑制系統功能增強，但其具體機制還有待進一步的研究。

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