日喀則綿羊溶血性曼氏桿菌的分離鑒定

元振杰，馬弘財，拉巴次旦，曾江勇

(西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏 拉薩 850009)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)又稱溶血性巴氏桿菌，該菌屬于條件性致病菌，可長期寄生于牛、綿羊、山羊等反芻動物及其它動物的上呼吸道[1-2]。當受到外界環境氣候聚變、長途運輸等刺激時，致使動物機體抵抗力下降，病原可趁機侵入機體而致病；在發生病毒和支原體感染如副流感病毒、綿羊肺炎支原體、多殺性巴氏桿菌病等，也可使該病的易感性增加[3-4]。一般認為該菌只有毒力較強的致病菌才有致病性[5]，目前國內外對其報道的較多，它能夠引起牛和綿羊的肺炎、新生羔羊急性敗血癥，給養牛和養羊業帶來較大的經濟損失，據報道全球30 %的病死牛與該病菌有關。該病每年給北美國家導致發經濟損失已超過10億美元[2]。

2018年4月，西藏自治區日喀則市崗巴縣某養羊場發生疫情，每天病死綿羊5～10只，死亡率達10 %以上，發病綿羊主要表現為咳嗽、喘氣、呼吸急促、鼻流黏液等呼吸道癥狀，并伴有體溫升高、精神沉郁、四肢僵硬等其它癥狀。筆者采集其內臟和血液樣本，通過病原分離培養、細菌16srRNA測序和產物比對，確定所分離的細菌為溶血性曼氏桿菌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

5 %脫纖綿羊鮮血平板、5 %犢牛血清TSA瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、麥康凱瓊脂(MAC)培養基來自甘肅農業大學動物疫病診斷中心實驗室，PCR反應體系、DNAmarker、核酸提取試劑購自TaKaRa，核酸回收試劑盒購自于北京全氏金生物技術有限公司，其它試劑均為國產分析純。

1.2 試驗動物

發病綿羊為西藏自治區日喀則市崗巴縣某養羊場。實驗用鼠為32日齡昆明系健康小白鼠8只，隨機分為2組，來自甘肅農業大學動物疫病診斷中心實驗室。

1.3 發病綿羊臨床癥狀與剖檢情況

發病綿羊主要表現為咳嗽、喘氣、呼吸急促、鼻流黏液等呼吸道癥狀，并伴有體溫升高、精神沉郁、四肢僵硬等其它癥狀。

通過對病死羊進行剖檢，發現病死羊的胸腔有大量積液，肺部有嚴重淤血，氣管和支氣管黏膜有大量黏液分布，部分病死羊膽囊腫大，小腸充血嚴重。病理變化符合溶血血曼氏桿菌感染的基本特征。

無菌采集發病綿羊和瀕死綿羊頸靜脈血液5 mL，無菌采集瀕死綿羊和死亡綿羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結組織樣品，送甘肅農業大學動物疫病診斷中心實驗室通過病原分離培養、細菌16 srRNA測序和產物比對進行分析。

1.4 病原的分離

將無菌采集發病綿羊頸靜脈血液，瀕死綿羊和死亡綿羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結組織樣品，分別將其接種于5 %脫纖綿羊鮮血平板、5 %犢牛血清TSA瓊脂平板、MAC平板，37 ℃恒溫培養24 h，挑取單個菌落進一步分離純化。觀察菌落特征，并挑取單個菌落進行涂片革蘭氏染色鏡檢，所有試驗在甘肅農業大學動物疫病診斷中心實驗室進行。

1.5 致病性試驗

將所分離的單個菌落分別接種于含犢牛血清的TSA液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h，取培養后的菌液0.5 mL腹腔分別注射給已分好組的小白鼠，別外一組腹腔注射0.5 mL生理鹽水做為對照，觀察并記錄小白鼠發病及死亡情況。對死亡的小白鼠進行剖檢，采集肺、肝、脾等發病組織進行細菌分離培養。

1.6 分離菌的16SrRNA擴增與序列分析

試驗在采用常規的方法用基因提取試劑盒，對分離的細菌提取DNA，以提取的DNA為模板，使用16SrRNA通用引物(上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增，目標片斷約為1400 bp。PCR反應體系為：PCR-MIX12.5 μl,ddH2O 9.5 μl，模板1 μl，上下游引物各1 μl。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，共進行35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠后通過膠回收試劑盒回收目的基因片斷，然后送住西安擎科生物進行測序。將測序結果通過在NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)進行BLAST同源性比對，確定該細菌的種屬。

2 結果與分析

2.1 臨床與剖檢診斷

根據發病綿羊和瀕死綿羊的臨床癥狀與剖檢瀕死綿羊和死亡綿羊的剖檢病理變化，符合溶血性曼氏桿菌感染的基本特征，即初步診斷為綿羊溶血性曼氏桿菌病。

2.2 細菌的分離與培養

通過對12份病變樣本分別接種于5 %脫纖綿羊鮮血平板、5 %犢牛血清TSA瓊脂平板、MAC平板培養24 h后，在所有采集的肺病料中均培養大量呈圓形、光滑、具有溶血性、半透明的小菌落。革蘭氏染色呈革蘭氏陰性、短小的桿菌(圖1)。

2.3 分離菌株16SrRNA基因序列擴增與分析

以3株分離菌株的基因組為DNA模板，采用16 srRNA通用引物進行擴增，產物通過瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果可見約1400 bp的特異性條帶，與預期的目的片斷一致(圖2)。測序結果通過NCBI中GenBank數據庫進行比對分析，確定為溶血性曼氏桿菌(圖3)。

圖1 分離的細菌形態學觀察

M：DNA marker 2000；1、2、3為樣本圖2 分離菌株PCR擴增電泳檢測

2.4 致病性試驗結果

試驗組小白鼠在腹腔注射后約6 h后開始出現動作緩慢、精神沉郁；12 h后約有75 %死亡(3/4)；在試驗24 h試驗組小白鼠全部死亡；生理鹽水對照組正常，未出現發病癥狀。對死亡的小白鼠進行剖檢，發現其肺部嚴重出血淤血，取樣品進行細菌分離培養，分離到與試驗結果相同的菌株。

2.5 試驗結果分析

本研究通過對西藏自治區日喀則市崗巴縣某羊場患病羊的內臟組織進行病原分離，經菌落形態、染色鏡檢初步鑒定該細菌為溶血性曼氏桿菌，再結合PCR方法對細菌16 S rRNA基因進行擴增和序列比對分析，最終確定為該菌為溶血性曼氏桿菌。通過實驗小白鼠動物致病性試驗表明該菌株具有很強的致病性。

3 討 論

溶血性曼氏桿菌是牛和羊上呼吸道的一種常在的共生菌，一般認為毒力較強的致病菌才有致病性[6]，該菌主要引起肺炎、新生羔羊、羊乳腺炎等，也是犢牛“船運熱”的主要病原，其大多數可以是從肺臟中分離得到，也有少數從鼻腔拭子中成功分離的報到[7-8]。目前該病國外對其的報道較多，每年給北美國家的養牛業造成了很大的損失[9]。在國內也有相關報到，馮旭飛等對四川地區臨床采集的 120 份肺組織和鼻拭子進行檢測，結果檢出率達51.67 %[10]；李娟等、徐慧等和李雪霞等分別證實了該病原在江蘇、新疆和云南地區的流行[8,11-12]。

圖3 16s rRNA NCBI數據庫比對結果

結合調研及實驗室檢測結果，此次發病的主要原因為：一是飼養管理方式的突然轉變。在發生此病之前，該羊殖場的羊均在在A鄉放牧飼養，后突然轉到B鄉進行集中圈舍養殖，且路途較遠，可能是該病發生的誘因。二是因飼草料不足，致使羊群整體營養不良、體質較差、抵抗力較差，是致使發病的內在因素。三是因B鄉晝夜溫差較大，基礎設施條件較差，部分羊發生了呼吸道疾病，沒有得到及時的治療，且有寄生蟲病感染，致使共生菌乘虛而入，是此次外病的外來因素，最終致使此次疾病的發生。因此，為有效防控該病的發生，建議采取以下措施：一是加強補飼青干草及精料，補充營養需求，提高免疫力。二是改善飼養條件，夜間采取防風保暖措施。三是加強管理，減少飼養管理方式的轉變和運輸期間的不適應、應激情況。四是制定有效的治療計劃，加強環境衛生和消毒工作，選用敏感藥物進行對癥治療。據相關研究報道，溶血性曼氏桿菌已對部分藥物如物如氨基糖苷類、四環素類、磺胺類和β-內酰胺類藥物產生了耐藥性[13-14]，在臨床治療時應選用大多數敏感性較高的諾氟沙星、阿米卡星、美洛西林、多西環素、頭孢噻肟等藥物進行治療[15-16]。