O2/CO2氣調下西蘭花能量代謝與貯藏品質的關系

王 亮，陳 勇，郭衍銀*，員麗蘋，劉莎莎，張玉笑，張新華

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

西蘭花因其低熱量、高膳食纖維及豐富的抗氧化物質，深受消費者喜愛[1]。然而，西蘭花屬典型的呼吸躍變型蔬菜，采后代謝十分旺盛，極不耐藏，常溫下2～3 d即發生褪綠、花蕾開放及黃化，導致花球營養成分含量急劇下降，同時，西蘭花組織鮮嫩多汁，花球部分基本無保護層，這使得西蘭花在貯藏過程中極易失水萎蔫、耐貯性差，嚴重影響其使用價值和市場價值[2]。為此，國內外學者對西蘭花保鮮做了大量研究，如郭香鳳等[3]研究表明低溫冷藏（4 ℃）可顯著抑制西蘭花凈菜組織的褪綠黃化和褐變，減緩組織中蛋白質、抗壞血酸及可溶性固形物等營養物質含量的下降，較好地保持細胞膜的完整性，有效地抑制西蘭花組織的衰老和品質劣變。Xu Chaojiong等[4]研究發現5 ℃、體積分數21% O2＋10% CO2氣調有利于西蘭花保持較高的蘿卜硫苷和醌還原酶活性，維持西蘭花感官品質。Ma Gang等[5]研究表明5 μL/L 1-甲基環丙烯處理可延緩西蘭花黃化并且抑制乙烯的產生，從而有效延緩西蘭花的衰老。Alvarez等[6]研究發現對西蘭花殼聚糖涂膜可有效抑制微生物的繁殖，達到較好的保鮮效果。本課題組前期研究表明，相較于一般氣調，O2/CO2氣調表現出獨特的優勢[7-8]，西蘭花在0、10、20 ℃條件下分別保鮮49、31、14 d，保鮮期均比同溫度下的其他氣調處理組長[9]，但具體機理特別是O2/CO2氣調對西蘭花能量代謝的影響尚缺乏深入探討。ATP作為細胞的能量貨幣，是細胞功能代謝和生存能力的主要決定因素。研究表明，采后果蔬的衰老與果蔬體內能量狀況有關[10]。如較高的能量水平可維持南果梨細胞膜穩定性、減少衰老過程中冷害和褐變的產生[11]；桃果實組織的能量狀態在維持細胞膜的完整性中起重要作用[12]；荔枝果皮褐變與ATP水平較高和電導率較低有關[13]。

為此，本實驗以西蘭花為材料，研究不同比例O2/CO2氣調對西蘭花能量、關鍵酶活力及品質指標的影響，探討O2/CO2氣調環境下西蘭花能量代謝和保鮮品質的關系，以期從能量代謝角度闡明O2/CO2氣調對西蘭花的保鮮機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的西蘭花采自山東省壽光市劉家茅坨村，采收后立即運到山東理工大學農業工程與食品科學學院農產品貯藏實驗室冷庫內，3 ℃預冷12 h后，選取花球直徑13～15 cm、花球緊密、色澤相似、沒有病蟲害和機械傷的西蘭花進行氣調處理。

2,4-二硝基苯肼 上海展云化工試劑有限公司；偏磷酸、冰醋酸、氯化鎂 天津致遠化學藥劑有限公司；濃硫酸、琥珀酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；2,6-二氯酚靛鈉、甲硫酚嗪、還原型細胞色素c、丙酮酸鈉、二硫蘇糖醇、三磷酸腺苷 上海索萊寶生物科技有限公司；高氯酸 上海桃浦化工廠；甲醇（色譜純）煙臺市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1750型紫外-可見分光光度計 日本島津國際貿易有限公司；600e型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有紫外檢測器）美國Waters公司；HP-2132便攜式色差儀 深圳漢譜光彩科技有限公司；PHS-25型pH計 上海存聯工貿有限公司；DW-FW351型低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；AL-1D4型精密分析天平 德國梅特勒-托利多儀器有限公司；GL-20G-2型臺式多功能高速冷凍離心機 上海安亭儀器制造廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

將預冷后的西蘭花分為4 組，每組30 個。將4 組西蘭花分別放入氣調箱中，并放入（10.0±0.5）℃冷庫中，然后分別通入不同比例的O2、CO2，4 組氣體的比例（均以體積分數計）分別為：20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2、80% O2＋20% CO2和自然空氣（CK）。具體通氣操作參照郭衍銀等[8]的方法進行。每個處理組3 次重復，即每個氣調箱放10 個西蘭花。貯藏過程中，每4 d取樣1 次，進行相應指標的測定，當西蘭花30%出現黃化或腐爛或異味時，即終止貯藏[14]。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 pH值的測定

pH值采用pH計法[15]測定。

1.3.2.2 琥珀酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、細胞色素c氧化酶活力的測定

琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力參照Ackrell等[16]的方法，通過分光光度法測定；丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH活力參照Nemeria等[17]的方法測定；細胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）活力參照熊杰等[18]的方法測定。

1.3.2.3 能荷的測定

ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量參照Zhou Qian等[19]的方法測定。樣品先用10 mL 0.6 mol/L高氯酸在冰浴中提取，采用HPLC儀測定ATP、ADP和AMP的含量。色譜柱為ODS柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；檢測波長為254 nm。流動相A為由0.06 mol/L磷酸氫二鉀和0.04 mol/L磷酸二氫鉀配成的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），流動相B為100%甲醇（色譜純），洗脫程序為：0～7 min，100%（體積分數，下同）流動相A；7～9 min，80%流動相A；9 ～10 min，75%流動相A；10 min，100%流動相A。流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。重復3 次，結果以鮮質量計。能荷按照下式進行計算。

式中：ATP、ADP及AMP分別表示各自的含量/（μg/g）。

1.3.2.4 VC含量的測定

VC含量采用2,4-二硝基苯肼法比色法[20]測定，結果以鮮質量計。

1.3.2.5 色調的測定

西蘭花色調的測定參考Li Dong等[21]的方法，使用便攜式色差計測定a、b值。當a＞0且b＞0時，H=tan-1（b/a）；當a＜0且b＞0時，H=180°＋tan-1（b/a）。

1.3.2.6 水分質量分數的測定

水分質量分數采用干燥法進行測定。

1.4 數據統計與分析

所得數據使用SPSS 13.0軟件進行最小顯著性差異法分析及Pearson法進行相關性分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中pH值的影響

圖1 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中pH值的影響Fig. 1 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on pH of broccoli during storage

細胞內pH值是影響細胞生理代謝的重要因素[22]。如圖1所示，CK組在貯藏期間pH值基本維持平穩狀態，但不同O2/CO2氣調處理的西蘭花pH值呈現出不同的變化趨勢。80% O2＋20% CO2處理組的pH值在貯藏期間整體低于CK組，但也基本處于穩定水平；隨著CO2比例的升高，西蘭花pH值呈現逐漸降低趨勢，如80% O2＋20% CO2、50% O2＋50% CO2和20% O2＋80% CO2處理組的西蘭花在整個貯藏期間平均pH值分別為6.54、6.19和6.04，分別比CK組（6.62）低1.21%、6.50%和8.76%。

2.2 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中PDH、SDH和CCO活力的影響

圖2 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中PDH（A）、SDH（B）及CCO（C）活力的影響Fig. 2 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on PDH (A), SDH (B)and CCO (C) activities of broccoli during storage

PDH是呼吸代謝過程中丙酮酸進入三羧酸循環的關鍵酶，是催化丙酮酸氧化脫羧的重要酶之一，在新陳代謝調節中起著極其重要的作用[23]。由圖2A可知，各組PDH活力在貯藏過程中均呈先上升后下降的趨勢，但其峰值出現的時間不同，CK組和80% O2＋20% CO2、50% O2＋50% CO2、20% O2＋80% CO2處理組的PDH活力峰值分別出現在第8、12、16、12天，說明適宜的O2/CO2氣調處理能延緩PDH活力峰值的出現。同時，8 d之后各組PDH活力在相同貯藏時間時均存在顯著差異（P＜0.05），整個貯藏期間CK、20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO24 個處理組PDH活力平均值分別為15.70、8.38、16.90、15.89 U/（g·min）。

SDH是三羧酸循環中一種重要的酶，其催化琥珀酸脫氫轉化成延胡索酸，促使黃素腺嘌呤二核苷酸接受脫下的H＋，最終氧化黃素腺嘌呤二核苷酸遞氫體產生ATP，為生命活動提供能量。CCO是呼吸鏈的末端酶，能夠將電子傳遞給O2，與能量的產生密切相關[23]。由圖2B、C可知，各組西蘭花在貯藏過程中SDH、CCO活力變化趨勢相似，均是先上升后降低，只是兩者活力峰值出現的時間稍有差異，SDH活力的峰值主要出現在第12天，而CCO則主要出現在第8天。就貯藏期間SDH和CCO活力的平均值而言，20% O2＋80% CO2處理組最低，分別為0.015、1.4 U/（g·min），低于CK組（分別為0.016、1.7 U/（g·min））；50% O2＋50% CO2處理組最高，分別為0.018、1.9 U/（g·min），分別比CK組高12.5%和11.76%。

對于PDH、SDH和CCO活力，80% O2＋20% CO2處理組在貯藏前期均高于50% O2＋50% CO2處理組，但貯藏后期則顯著低于50% O2＋50% CO2處理組（P＜0.05），表明高比例O2雖可促進西蘭花貯藏前期PDH、SDH和CCO活力升高，但缺乏持續性和穩定性，造成貯藏后期酶活力迅速下降。

2.3 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中能荷的影響

圖3 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中能荷的影響Fig. 3 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on energy charge of broccoli during storage

植物體內的能荷大小可反映其體內的能量水平和產生狀況[24]。如圖3所示，各組西蘭花體內能荷在貯藏過程中均呈下降趨勢，其中CK組與20% O2＋80% CO2處理組能荷下降最為迅速，16 d內分別下降了56.08%與46.57%。相比而言，50% O2＋50% CO2與80% O2＋20% CO2處理組的西蘭花能荷下降較為緩慢，16 d內下降了19.32%和30.68%，這兩組的能荷在0～12 d下降緩慢，從0 d時的0.81分別下降到0.73和0.75，僅分別下降了9.9%和7.4%，之后（12～28 d）能荷迅速下降，分別下降了53.34%和63.90%。

2.4 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中VC含量的影響及與能荷的相關性分析

圖4 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中VC含量的影響Fig. 4 Effect of modified O2/CO2 controlled atmospheres on ascorbic acid content of broccoli during storage

西蘭花體內VC含量的高低可作為評價其貯藏品質的有效指標[25]。如圖4所示，隨著貯藏時間的延長，各組西蘭花VC含量均呈下降趨勢，但下降速率不同。其中，CK組VC含量呈線性下降趨勢，16 d內下降了72.7%；50%O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2處理組在貯藏前期下降較慢，0～16 d時分別下降了23.5%和28.9%，16～28 d時則分別下降了39.9%和42.8%。

表1 西蘭花VC含量與能荷的相關性分析（以貯藏16 d內的數據計算）Table 1 Correlation analysis of ascorbic acid and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

相關性分析表明，貯藏期間各處理組VC含量與能荷之間存在明顯的正相關性（表1），除80% O2＋20% CO2處理組的相關系數為0.732外，其余處理組的相關系數范圍為0.96～0.98，表明貯藏期間西蘭花能荷水平與VC含量密切相關。

2.5 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中色調的影響及與能荷的相關性分析

H值由高到低的變化反映了西蘭花逐漸黃化的過程[26]。隨著貯藏時間的延長，各處理的H值均呈下降趨勢（圖5），其中CK組下降最快，16 d內下降了20.87%。氣調處理減緩了西蘭花H值的降低，20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2處理組在16 d內分別下降了12.11%、11.05%和12.54%，表明合適的CO2比例對葉綠素降解具有很好的抑制作用。

圖5 O2/CO2氣調對西蘭花色調的影響Fig. 5 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on H value of broccoliduring storage

表2 西蘭花色調與能荷的相關性分析（以貯藏16 d內的數據計算）Table 2 Correlation analysis of color value and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

由表2可知，除80% O2＋20% CO2處理組的西蘭花色調與能荷相關系數為0.799外，其余組均高于0.80，CK組的相關系數高達0.986，表明能荷與西蘭花色調存在很高的相關性。

2.6 O2/CO2氣調對西蘭花貯藏過程中水分質量分數的影響及與能荷的相關性分析

圖6 O2/CO2氣調對西蘭花水分質量分數的影響Fig. 6 Effect of O2/CO2 controlled atmospheres on water content of broccoli during storage

西蘭花組織鮮嫩多汁，在貯藏期間極易失水導致品質惡化，水分質量分數可作為評價西蘭花品質的重要指標。如圖6所示，貯藏期間各組西蘭花的水分質量分數呈下降趨勢，其中CK組下降最快，16 d內下降了6.71%，高于20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2和80% O2＋20% CO2處理組（分別為5.64%、2.76%和4.55%）。相比較而言，50% O2＋50% CO2處理組水分質量分數下降最慢，0～20 d范圍內僅下降了4.17%，明顯低于80% O2＋20%和20% O2＋80% CO2處理組（分別為5.84%和7.84%）。相關性分析（表3）表明，各處理組水分質量分數與能荷之間存在顯著或極顯著的相關性（P＜0.05，P＜0.01），除80% O2＋20% CO2處理組相關系數為0.888外，其余組均高于0.90。

表3 西蘭花水分質量分數與能荷的相關性分析（以貯藏16 d內的數據計算）Table 3 Correlation analysis of water content and energy charge in broccoli (according to data over a 16 d storage period)

3 討 論

本課題組前期研究發現，10 ℃下，50% O2＋50% CO2處理能很好地保鮮西蘭花[9]，為了探討和對比O2/CO2氣調對西蘭花貯藏期間能量代謝和貯藏品質的關系，本實驗除設置50% O2＋50% CO2處理組外，還設置了20% O2＋80% CO2、80% O2＋20% CO2兩個極限條件，目的在于探究O2/CO2氣調下保鮮效果與能量水平之間的關系。

pH值是細胞生理活動的重要調節因素，它不僅能夠調節細胞的一些酶活性，也調節細胞內一些生理活動和代謝過程[27]，同時，植物體內的呼吸代謝相關酶活性決定著能荷水平。Mathooko[28]認為，高濃度CO2可引起細胞pH值下降，進而使得整個呼吸途徑出現紊亂，如較低pH值可造成SDH活性降低，造成琥珀酸和蘋果酸的積累，致使三羧酸循環難以持續。Blanch等[29]指出，高濃度CO2處理可增加草莓細胞膜通透性、加速細胞膜降解，并降低ATP含量及能量的利用效率。本研究結果表明，與50% O2＋50% CO2處理組相比，過高比例的CO2如20% O2＋80% CO2處理引起西蘭花貯藏過程中pH值降低（圖1），進而造成PDH、SDH和CCO活力的下降（圖2）和能荷水平的降低（圖3），與Mathooko[28]的研究結果一致。過高比例的O2如80% O2＋20% CO2處理雖在貯藏前期使PDH、SDH和CCO活力提高，但使其后期迅速下降，降低了貯藏期間西蘭花后期的能量產生效率，同樣不利于維持平穩而持續的能量供應。

郭衍銀[8]、孫志文[7]等研究指出，高濃度O2不利于西蘭花葉綠素的保持，而適當濃度的CO2則利于綠色維持，本實驗西蘭花色調變化結果與以上研究一致。隨著貯藏時間的延長，CK組西蘭花的色調迅速降低，而另外3 個處理組西蘭花的色調雖有降低，但均高于CK組，進一步證實了CO2抑制葉綠素降解的作用。

Pan Yonggui等[30]研究表明，冷藏后木瓜體內能荷的降低導致冷害發生，且冷害指數與能量水平存在密切的相關性。劉亭等[31]研究結果表明，荔枝貯藏期間能荷水平與細胞膜通透性和果皮褐變指數呈明顯的負相關。VC含量、色調以及水分質量分數作為西蘭花品質指標，可直觀評價西蘭花貯藏條件的優劣。本實驗結果表明，能荷水平與西蘭花VC含量、色調及水分質量分數之間存在顯著或極顯著的正相關關系，CK、20% O2＋80% CO2、50% O2＋50% CO2、80% O2＋20% CO2處理組的能荷水平與VC含量之間相關系數分別為0.732～0.996，與色調之間的相關系數分別為0.799～0.986，與水分質量分數之間的相關系數分別為0.888～0.983。說明能荷水平可作為主要指標，綜合評價西蘭花貯藏條件的適宜性。

綜上所述，50% O2＋50% CO2處理可調節西蘭花體內pH值和呼吸關鍵酶活性，建立持續穩定的能量供應系統，并很好地維持西蘭花貯藏品質；CO2過高或過低均影響貯藏期間西蘭花能量的持續供應，并降低貯藏品質。相關性分析表明，西蘭花能荷水平和VC含量、色調及水分質量分數具有很高的相關性，可作為優化西蘭花貯藏條件的衡量指標。