AMPK抑制TGF-β信號通路減輕EMT誘導膀胱癌轉移機制研究

孔曉武　丁青　張琦

[摘要] 目的 探討AMPK抑制TGF-β信號通路減輕EMT誘導膀胱癌轉移機制。 方法 采用Lipofectamine2000介導AMPKα1轉染至人膀胱移行上皮癌BIU-87，噻唑藍（MTT）比色法和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測shRNA對細胞增殖和凋亡的作用。細胞劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗檢測體外細胞遷移和侵襲能力。Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達情況。 結果 轉染后的C4-2 DN細胞生長速度明顯慢于未轉染的BIU-87細胞及轉染空載體的C4-2 E細胞，且在24 h內的細胞凋亡率均明顯高于轉染空載體的C4-2 E，組間差異具有統計學意義（P<0.05）。AMPK抑制TGF-β信號通路能夠抑制人膀胱移行上皮癌BIU-87細胞的增殖和侵襲遷移（P<0.05）。同時，AMPK抑制TGF-β信號通路下調N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上調E-cadherin 蛋白表達。 結論 AMPK抑制TGF-β信號通路下調N-cadherin 和 Vimentin 蛋白水平，上調E-cadherin 蛋白表達，減輕EMT誘導膀胱癌轉移。

[關鍵詞] AMPK;TGF-β信號通路;EMT;膀胱癌;轉移

[中圖分類號] R737.14? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）12-0028-04

Mechanism research of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and alleviating the metastasis of EMT-induced bladder cancer

KONG Xiaowu1? ?DING Qing2? ?ZHANG Qi2

1.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital Haining Hospital， Haining Central Hospital， Haining 314408， China; 2.Department of Urology， Zhejiang Provincial People's Hospital， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the role of AMPK in inhibiting TGF-β signaling pathway and attenuating EMT-induced bladder cancer metastasis. Methods Lipofectamine2000 was used to mediate AMPKα1 transfection into human bladder transitional cell carcinoma BIU-87. The effect of shRNA on cell proliferation and apoptosis was detected by MTT colorimetric assay and AnnexinV-FITC/PI double staining. Cell scratch assay and Transwell chamber invasion assay were used to detect cell migration and invasion in vitro. The expression of E-cadherin， N-cadherin and Vimentin protein was detected by Western blot. Results The growth rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly slower than that of untransfected BIU-87 cells and C4-2 E cells transfected with empty vector， and the apoptosis rate of C4-2 DN cells after transfection was significantly higher than that of C4-2 E cells transfected with empty vector transfection within 24 h， and the difference between groups was statistically significant （P<0.05）. AMPK inhibits proliferation and invasion and migration of human bladder transitional epithelial carcinoma BIU-87 cells by inhibiting TGF-β signaling pathway （P<0.05）. At the same time， AMPK inhibits TGF-β signaling pathway and down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， and up-regulates E-cadherin protein expression. Conclusion AMPK inhibits TGF-β signaling pathway， down-regulates N-cadherin and Vimentin protein levels， up-regulates E-cadherin protein expression， and reduces EMT-induced bladder cancer metastasis.

[Key words] AMPK; TGF-β signaling; EMT; Bladder cancer; Metastasis

膀胱癌為泌尿系統常見惡性腫瘤之一，根據浸潤程度不同分為肌層浸潤性膀胱癌和非肌層浸潤性膀胱癌兩種。相關研究[1]結果顯示，肌層浸潤性膀胱癌遠處轉移程度高，病情進展快，5年存活率低于10%。因該類癌癥的發生與發展過程極為復雜，涉及多種抑癌基因及通路的抑制與激活情況[2]。故研究這些基因以及其中通路因子對癌癥發生、轉移的影響，對癌癥的治療以及預防具有一定意義。上游蛋白激酶（AMPK）是公認的具有抑癌功能的功能性物質，因腫瘤組織微環境或基因突變所致的AMPK活性下降是腫瘤發生發展的重要機制[3]。以往研究[4]表明，AMPK通過限制細胞周期檢查點或能量瓶頸，促進細胞凋亡，抑制增殖。轉化生長因子 β（TGF-β）信號的過度活躍則是腫瘤細胞復發及轉移的誘因，TGF-β通過誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進腫瘤細胞增殖與轉移[5-6]。但目前有關過度活躍的TGF-β 信號與AMPK活性下降是否有關，以及激活AMPK對TGF-β 信號轉導、EMT、腫瘤轉移的作用均鮮有報道。本研究通過考察AMPK對TGF-β信號及EMT 標志物的影響，探討AMPK抑制TGF-β信號通路減輕EMT誘導膀胱癌轉移機制。現報道如下。

1材料與方法

1.1 一般材料

2017年9月～2018年5月選用人膀胱移行上皮癌BIU-87，由上海市腫瘤研究所癌基因國家重點實驗室提供。二甲基亞砜及四甲基偶氮唑藍購自美國Sigma公司。LipofectamineTM轉染劑購自LTI公司。培養基、胎牛血清、單克隆抗體Vimentin、N-cadherin、E-cadherin購自上海基爾頓生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養? 采用含10%胎牛血清的1640培養基（含0.1%鏈霉素及青霉素）培養BIU-87為人膀胱移行上皮癌細胞株，在37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。以不轉染AMPKα1人膀胱移行上皮癌BIU-87細胞為對照組，以Lipofectamine2000介導AMPKα1轉染至人膀胱移行上皮癌BIU-87細胞為實驗組。

1.2.2 AMPK DN細胞株構建? 將AMPKα1亞單位顯性失活突變體（DN）、慢病毒包裝質粒、Lipofectamine 2000 按比例均勻滴入BIU-87細胞培養液，6 h后更換不含上述物質的新鮮培養液，孵育過夜，收集培養液上清，觀察細胞，上清液濃縮后儲存在-80℃冰箱。此外，將以 Scramble DNA代替目的基因轉染BIU-87細胞，為對照組（C4-2 E）細胞。

1.2.3 AMPK DN細胞株的篩選? 轉染72 h后，將1 μg/mL的Puromycin選擇培養液同時加入至3組細胞中并進行篩選，每隔2 d換液1次，對AMPK DN基因慢病毒感染 C4-2細胞進行篩選，并構建穩定細胞株（C4-2 DN）。

1.2.4 細胞劃痕實驗? 先用記號筆每隔 0.5～1.0 cm在6孔板底面劃一橫線進行標記，隨后每孔加入約5×105個細胞，培養過夜。PBS洗去細胞碎屑后，每個孔內分別加入含血清、無血清、含藥物、含 TGF-β1因子的不同培養基，低倍鏡拍照，記錄0 h時細胞數量，培養24 h后，再次拍照，計算遷移速率。

1.2.5 Transwell小室侵襲實驗? 將2×105個BIU-87細胞接種于8 μm 孔徑小室，下室加入含5 ng/mL TGF-β1培養液，上室則加入 10 mM AMPK抑制劑（二甲雙胍）。孵育過夜后，采用多聚甲醛溶液固定，室溫風干，0.1%結晶紫溶液染色，PBS清洗晾干后，100倍顯微鏡下觀察并計數細胞。

1.2.6 檢測細胞增殖并繪制細胞生長曲線[7]? 將C4-2 E細胞、C4-2 DN細胞、未轉染BIU-87細胞分別以每孔2×103個細胞接種于96孔培養板，并設不加細胞僅加培養液的試驗孔為空白對照孔。接種2 d后轉染，并在轉染24 h、48 h以及72 h棄去培養液，測定OD值。計算細胞生長率。接種2 d后每天取每種細胞6孔，通過四唑鹽比色試驗（MTT）法檢測細胞活性。在波長為492 nm下，讀取酶標儀上測定的各孔吸光度（OD）值，最終結果為6孔平均值，并以時間為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.2.7 檢測細胞凋亡? 分別于24 h、48 h、72 h 3個時相點收集C4-2 DN細胞及對照組細胞，制成濃度為 5×106/mL的細胞懸液，加1×105個細胞至流式管內，PBS洗滌3次，離心取沉淀，加入5 μL的 AnnexinV-FITC和PI，避光室溫放置5 min。60 min內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。PI通過FL2通道檢測紅色熒光，AnnexinV-FITC 通過FL1通道檢測綠色熒光。若AnnexinV-FITC與PI均為陽性，則為壞死細胞或晚期凋亡細胞，若AnnexinV-FITC陽性，PI陰性則為早期凋亡細胞，反之為正常細胞。

1.2.8 實時定量 PCR檢測基因轉錄水平的表達變化? 細胞經處理后用 Trizol 法提取總 RNA，定量后按照反轉錄試劑盒說明書合成 cDNA。隨后通過實時定量 PCR 進行擴增，并利用BioRad CFX Manager軟件進行定量分析。

其中引物序列如下：E-cadherin 正義5'-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3'，反義5'-GGGTGTCGAG-GGAAAAATAGG-3';N-cadherin正義5'-TCAG-GCGTCTGTAGAGGCTT-3'，反義5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3';Vi-mentin正義5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3'，反義5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3';β-actin正義5'-CATGTACGT-TGCTATCCAGGC-3'，反義5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。

1.2.9 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達情況[8]? 將細胞中的組織蛋白采用蛋白裂解液法進行提取，并通過Western blot法檢測其中的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達情況。

1.3統計學方法

應用 SPSS19. 0 統計軟件包進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組細胞的生長曲線

由封三圖6、7可知，轉染空載體BIU-87的細胞生長曲線與BIU-87細胞相似，而C4-2 DN細胞生長速度明顯慢于未轉染的BIU-87細胞及轉染空載體的C4-2 E細胞。BIU-87細胞生長7 h細胞數為（600.35±121.46），C4-2 DN細胞生長7 h細胞數為（325.14±102.47），C4-2 E細胞生長7 h細胞數為（598.77±119.58），三組比較，差異有統計學意義（F=4.720，P=0.002）。

2.2 不同組細胞的凋亡

C4-2 DN細胞在24 h、48 h及72 h細胞凋亡率均明顯高于轉染空載體的C4-2 E的細胞，且組間差異具有統計學意義（P<0.05），見封三圖8、圖1及表1。

2.3 AMPK抑制TGF-β誘導的細胞遷移

進行細胞劃痕實驗時，分別給TGF-β1、AMPK 激活劑處理，24 h時后觀察結果顯示，AMPK 激活劑處理的劃痕間距明顯寬于TGF-β1 因子刺激組。隨后的transwell實驗結果顯示，AMPK 激活劑處理組遷移細胞數（0.23±0.02）明顯少于TGF-β1 因子刺激組（0.59±0.11），組間差異具有統計學意義（t=3.256，P=0.00），見封三圖9、10。

2.4 AMPK對膀胱癌細胞EMT的影響

實時定量PCR顯示，AMPK 激活劑處理后細胞內E-cadherin 的 mRNA水平上調，N-Cadherin和Vimentin的mRNA水平下調（P<0.05，表2）。此外，通過Western blot發現AMPK 激活劑處理后細胞內的N-Cadherin和Vimentin蛋白水平明顯下調，E-cadherin蛋白表達上調，見圖2。

3討論

本研究主要比較不同轉染組及未轉染組之間的細胞生長規律，結果顯示，轉染空載體BIU-87的細胞生長曲線與BIU-87細胞相似，而C4-2 DN細胞生長速度明顯慢于未轉染的BIU-87細胞及轉染空載體的C4-2 E細胞，且C4-2 DN細胞在24 h細胞凋亡率均明顯高于C4-2 E細胞，提示轉染AMPK能夠抑制BIU-87細胞的生長;對比轉染AMPK的C4-2 DN細胞與僅轉染空載體的C4-2 E細胞兩者生長情況后發現，轉染AMPK的C4-2 DN細胞生長速率明顯低于僅轉染空載體的C4-2 E細胞，在24 h凋亡率均明顯高于轉染空載體C4-2 E細胞，進一步驗證了抑制BIU-87細胞生長的因素是AMPK，而不是載體Lipofectamine2000。分析AMPK抑制膀胱癌細胞生長的機制，可能與以下機制有關：（1）AMPK 具有抑制TSC2-mTOR蛋白合成，間接地抑制腫瘤細胞生長與增殖的功能[9-10];（2）AMPK 通過調節 p53-p21表達，從而平衡細胞的增殖與凋亡，調控細胞周期[11];（3）AMPK通過上調p53蛋白水平，阻斷細胞周期，促進腫瘤細胞凋亡[12-13];（4）AMPK能夠抑制TGF-β誘導的Smad2/3磷酸化，阻斷Smad2/3核定位[14]，從而阻礙腫瘤細胞的轉錄反應，發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用。

為進一步探討AMPK與TGF-β 信號通路間的關系，本研究分別給TGF-β1、AMPK 激活劑處理BIU-87細胞進行細胞劃痕試驗，結果顯示，AMPK激活劑處理的劃痕間距明顯寬于TGF-β1因子刺激組，提示AMPK對于細胞遷移的抑制作用與TGF-β信號通路有關。而Transwell實驗結果也證實了這一點，AMPK激活劑處理組遷移細胞數明顯少于TGF-β1因子刺激組（P<0.05）。經Lin H等[14]研究證實，AMPK 可通過抑制 Smad2/3 靶標轉錄，從而降低TGF-β促轉移作用。

EMT是由上皮細胞變為間質細胞的過程，參與腫瘤細胞遠處遷移和局部浸潤。既往研究[15-17]表明，腫瘤細胞通過 EMT獲取間質細胞的侵襲性，從而浸潤至相鄰組織，最終形成腫瘤細胞的遠端轉移。此外，EMT過程中MMPs、N-cadherin、纖維連接蛋白（Fi-bronectin）、波形蛋白（Vimentin）等間質細胞因子表達增加，E-鈣黏著蛋白（E-cadherin）的合成受到抑制，細胞極性降低，緊密連接破壞，間質特征增強[18]。本次研究結果發現，AMPK激活劑處理后細胞內的N-cadherin和Vimentin蛋白水平明顯下調，E-cadherin蛋白表達上調，提示AMPK具有抑制EMT進程的能力。由于TGF-β/Smad信號通路是誘導EMT的關鍵通路[19]，AMPK能夠阻斷TGF-β/Smad信號通路，因此也能夠抑制EMT進程，從而影響上皮細胞特征標志物（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin等）的表達。Bays JL等[20]發現，增強AMPK的活性，能夠明顯降低N-Cadherin和Vimentin蛋白水平，抑制腫瘤細胞的侵襲能力，降低腫瘤細胞的惡性程度。

綜上所述，AMPK活性大小與膀胱癌的發生、發展關系密切，其在人體內的表達缺失、突變或許是膀胱癌早期癌變的預兆，AMPK通過抑制TGF-β信號通路減輕EMT誘導膀胱癌轉移，有望成為膀胱癌未來診斷以及治療的潛在靶標，為疾病的治療提供新思路。

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