β-細辛醚對多房棘球蚴的體外殺傷作用※

鄭 佳，李占強，楊全余，廖夢姣，張 穎，胡繽文，湯 鋒#，李潤樂&

(1.青海大學高原醫學研究中心，青海省高原醫學應用基礎重點實驗室，高原醫學教育部重點實驗室，青海 西寧 810001；2.青海大學醫學院，青海 西寧 810001；3.青海省人民醫院，青海 西寧 810001；4.遵義第五附屬醫院，貴州 遵義 536000)

目前治療包蟲病的臨床藥物主要是阿苯達唑。近年來，我們在中藥中發現石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)具有殺傷棘球蚴作用，本研究意圖尋找其產生作用的單體化合物。

α-細辛醚和β-細辛醚是石菖蒲根莖中的有效成分[1]。有文獻顯示菖蒲屬金錢蒲的己烷提取物，具有殺蟲活性，活性成分為α-細辛醚和β-細辛醚。本研究擬通過體外實驗對比α-細辛醚和β細辛醚對多房棘球蚴的殺傷效果，并對不同劑量殺傷效果進行檢測，初步明確細辛醚對多房棘球蚴的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青霉素-鏈霉素混合溶液(Solarbio)，α-細辛醚(成都埃法生物公司，純度>98%)，β-細辛醚(成都埃法生物公司，純度>98%)，阿苯達唑(梯希愛公司，純度>98%)。

BB15型培養箱(Thermo公司)，Axio Vert.A1型光學顯微鏡(Carl Zeiss Jena公司)。

1.2 方法

1.2.1 α-細辛醚和β-細辛醚藥物作用效果檢測

多房棘球蚴的分離及體外培養方法詳見本課題組前期研究報道[2，3]。α-細辛醚和β-細辛醚分別用DMEM培養基稀釋至5 mg/mL，將2 mL藥物稀釋液分別加入到含有1 000個原頭蚴的6孔板中，每組三個復孔。在培養箱中(5% CO2，37℃)培養30 min。將阿苯達唑用DMEM培養基稀釋至5 mg/mL，作藥物對照。

1.2.2 β細辛醚不同濃度作用效果檢測

1.2.3 原頭蚴表面結構變化觀察

將藥物作用后的多房棘球蚴采用掃描電鏡樣本制備的方法[4]處理后觀察其表面結構。

1.2.4 統計學處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。結果以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重兩兩比較使用Dunnett-t檢驗或LSD檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 α-細辛醚和β-細辛醚對多房棘球蚴殺傷作用的藥效學評價

將濃度為5 mg/mL的α-細辛醚、β-細辛醚、阿苯達唑在培養基與多房棘球蚴共培養30 min。每孔吸出10 μL用伊紅染色，光鏡下觀察發現5 mg/mL β-細辛醚組內多房棘球蚴被伊紅染色，如圖1A所示。5 mg/mLβ-細辛醚、阿苯達唑組內多房棘球蚴未被染色，如圖1B、C所示。空白對照組多房棘球蚴沒有被伊紅染色。

2.2 不同劑量β-細辛醚對多房棘球蚴殺傷作用的評價

將濃度分別為5.00、2.50、1.25、0.75 mg/mL的β-細辛醚與多房棘球蚴共培養，分別在0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、30.0 h時吸取10 μL多房棘球蚴溶液，染色發現5 mg/mL和2.5 mg/mL的β-細辛醚分別在0.5 h和2 h時，全部被伊紅染色。與濃度為1.25 mg/mL、0.75 mg/mL的β-細辛醚分別作用20 h后，死亡率分別為(98.9±0.4933)%和(64.33±2.333)%，如圖2所示。

2.3 對β-細辛醚作用后的多房棘球蚴的表面結構觀察

與2.5 mg/mL β-細辛醚作用2 h后的多房棘球蚴立刻用3%戊二醛固定。用掃描電鏡進行觀察，結果顯示空白對照組多房棘球蚴體表完整，原頭蚴形態正常，圖3白色箭頭所示頭部微絨毛豐富且整齊，而藥物作用后多房棘球蚴體表凹凸不平，頭部無微絨毛且形態不完整，鉤疑似已脫落。

A：β-細辛醚；B：α-細辛醚；C：阿苯達唑；D：空白對照圖1 α-細辛醚和β-細辛醚對多房棘球蚴的殺傷作用圖Figure 1 The effect of α-asarone and β-asarone on protoscoleces

A：0.75 mg/mL β-細辛醚作用20 h；B：1.25 mg/mL β-細辛醚作用20 h；

A 空白對照；B β-細辛醚

3 討論

石菖蒲揮發油中細辛醚類為主要的活性成分，其中α-細辛醚占0.3%、β-細辛醚占0.7%[5]。本研究顯示β-細辛醚具有很好殺滅多房棘球蚴的作用。

很多藥物的活性與其空間結構有密切的關系，藥物的不同立體結構會影響藥物活性[6]，在很多藥物順反異構體中只有其中一種具有藥物活性，比如乙烯雌酚、維生素A、頭孢噻肟鈉、亞油酸、花生四烯酸、順鉑等。α-細辛醚和β-細辛醚是順反異構體，α-細辛醚為(E)-1，2，4-三甲氧基-5-丙烯基苯，β-細辛醚是(Z)-1，2，4-三甲氧基-5-丙烯基苯。本研究發現只有β-細辛醚對多房棘球蚴具有殺傷作用，α-細辛醚隨時間推移對多房棘球蚴無任何殺傷作用，因此這兩種藥物的甲氧基和丙烯基的空間位置結構可能影響了對多房棘球蚴的殺傷作用。一般來說反式結構更為穩定，順式結構在一定情況會向反式結構轉變[7，8]，本文結果中β-細辛醚具有針對多房棘球蚴的殺傷作用，在該藥物的應用中應考慮到該藥物空間結構不穩定容易發生改變的情況，制劑時應添加穩定劑等。

有研究表明，β-細辛醚可降低癲癇小鼠腦皮質GAD65的表達及Glu、GABA的含量，且呈明顯的量效關系，50 mg/kg/d組與基質對照組不具統計學差異[9]。朱彩霞等[10]研究發現β-細辛醚15、30 mg/kg組可顯著增加抑郁小鼠腦、紋狀體中5-HT、5-HIAA的含量，7.5 mg/kg組差異不顯著。因此β-細辛醚的濃度對其藥效有影響。本研究在確定β-細辛醚具有殺傷作用后，又進一步對其不同劑量作用時間進行評價，發現β細辛醚在5 mg/mL時可在0.5 h內殺滅所有多房棘球蚴，隨濃度的降低完全殺滅的時間變長，顯示濃度對多房棘球蚴殺傷效果有影響。

本研究僅說明β-細辛醚在體外對多房棘球蚴具有較好的殺傷作用。但在體內其是否具有相同作用有待進一步確認。