激光掃描共聚焦顯微鏡玻片高通量自動化成像的方法＊

王瑾瑜，王文娟，曹慧珍

（清華大學生命科學學院，北京 100084）

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）在目前生物學和醫學領域中對細胞、病例等微小信號進行觀察和檢測起到了重要的作用，是熒光成像和細胞組織分析的重要工具之一[1-2]。它是以激光束為光源，在顯微鏡的基礎上增加了掃描單元、共軛小孔和檢測單元。LSCM對熒光樣品激發以后，共軛小孔排除非焦面的信號，獲得高信噪比、高分辨率的圖像[3]。LSCM 可以檢測細胞、組織、活體等帶有熒光標簽的樣品，可適配35 mm/50 mm/60 mm 培養皿、載玻片、腔室培養皿、孔板等培養容器，但均需人工操作。將樣品放于LSCM上，用低倍鏡觀察并將感興趣的區域放于視野中央，切換到所需的高倍鏡下觀察。

近年來，生物學的研究越來越依靠大數據說明具體的問題，這就需要保證實驗的規模和數據的層次，單一的成像檢測已經滿足不了相關的研究，因此，高通量成像逐步興起，在獲得大量數據的同時，還可解決人工手動操作的問題。

目前高通量成像主要被用于藥物研發中，樣品主要以細胞為主，培養細胞以孔板為主[4-7]，它結合了高通量篩選技術的效率和細胞影像學技術的成像和分析能力，能夠快速地從復雜的生物系統中收集到大量數據[8]。對于做免疫熒光的細胞和組織制作成裝片，很難用目前市面上的設備進行高通量的拍攝，市面上有玻片掃描儀可進行多玻片的熒光成像和病理成像，但是均基于普通的寬場顯微鏡[9]，相較于LSCM 來說，這些設備分辨率低，放大倍數通常為4X、10X、20X、40X。而LSCM 的放大倍數可以達到100X，數值孔徑可達1.49。對于一些比較簡單的細胞計數，普通玻片掃描儀也可以達到實驗目的，但是對細胞結構有要求的實驗，必須使用LSCM，其分辨率高、信噪比高。針對這一問題，筆者使用本實驗室的LSCM 以免疫熒光脾臟裝片為例，介紹如何利用LSCM 進行高通量的自動拍攝。

1 LSCM 載物臺適配器的設計

隨著技術的發展，目前光學顯微鏡的載物臺都是電動載物臺，可以做大圖拼接成像[10]，但是大部分顯微鏡的樣品夾都只能放置單張載玻片，如圖1（a）所示。需要成像的實驗人員手動單張更換載玻片，延長了拍攝時間，而且需要大量的人工尋找樣品信息位置。這不僅限制了多樣本的檢測，還限制了自動拍攝程序的應用。目前市面上也有可以采購的玻片掃描儀和做藥篩的高內涵[11-12]，但是這些設備價格昂貴，成像效果一般，不夠靈活。之前也有多載玻片夾持組件的設計[13]，但比較復雜，機械臂價格昂貴，不能普及到每一臺光學顯微鏡上。

圖1 顯微鏡通用樣品適配器

倒置熒光顯微鏡和倒置激光掃描共聚焦顯微鏡電動載物臺的移動范圍是128 mm×86 mm，原設備廠家設計的載玻片適配器只能放一片載玻片，寬度為76 mm×26 mm。盡最大可能利用本身電動載物的移動范圍設計適配器，最大容量可以放置4 個載玻片，如圖1（b）所示。

2 高通量程序的應用

HCA/Jobs 是NIS-Elements 自帶用于復雜圖像采集和數據分析的可編寫的自動化程序模塊。目前針對固定樣品和活細胞樣品做了2 個模板，包括孔板、玻片、小皿等全部拍攝和部分拍攝，在拍攝后期直接可以增加分析和統計程序獲得結果，包括Excel、柱形圖、散點圖等。此外，在模板之外，還會幫用戶解決一些特殊的高通量實驗。

2.1 實驗方法

實驗材料為成年的B6 小鼠，實驗的儀器型號為超分辨率激光掃描共聚焦顯微鏡Nikon A1 HD25。實驗的具體操作流程如下：①對成年B6 小鼠進行手術，取其脾臟；②冠狀切面（35 μm）用低溫切片機（Leica）切割；③組織切片用含有5%的BSA（牛血清白蛋白）和0.3%的Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）的PBS（磷酸緩沖鹽溶液）封閉；④免疫熒光標記熒光探針；⑤盡可能多地鋪展在載玻片上，滴上封片劑，蓋上蓋玻片，制成裝片；⑥成像所需物鏡為1X、20X、40X，將蓋玻片朝下放置于多玻片適配器上，用螺絲固定在電動載物臺上。

多玻片高通量自動化程序的編寫如下：①打開NIS-Elements AR 5.2 的HCA/Jobs 模塊；②選擇工作區域，StageArea 確定區域rectangle 92.2 mm×38.6 mm；③確定1X 物鏡下的拍攝參數（128×128 分辨率模式，單通道熒光強度和HV 確保信背比為3∶1），掃描速度為4 fps，確定高倍物鏡（10X、20X、40X）下拍攝參數（1 024×1 024 分辨率模式，多通道熒光強度和HV確保信號足夠亮，但不過曝）；④將低倍物鏡切換到高倍物鏡時，pinhole 的大小沒有辦法關聯，可以寫一個命令，在切換物鏡后，通過macro 將pinhole size 調整到1.2 A U ；⑤用1 X 物鏡掃描所有區域，scan stageArea.StageArea.Area；⑥使用GA 分析模塊，通過therhold 將脾臟的區域選擇出來；⑦將所有的區域作為一個RegionList；⑧切換20X 物鏡，通過Autofocus 鎖定每個脾臟的焦面，對每個脾臟進行成像。多玻片高通量拍攝程序如圖2 所示。

圖2 多玻片高通量拍攝程序

2.2 實驗結果

編寫好的多波片高通量拍攝程序會自動切換到1X 物鏡下，以4 fps 的速度自動尋找每個玻片上的脾臟切片，然后定位，將選定區域加載為一個列表作為高倍鏡成像的選定區域。然后自動切換到高倍鏡下，轉換到雙通道拍攝，自動對焦，根據1X 物鏡下定位的樣品依次完成高倍鏡大圖拼接成像。即使大量樣品焦面不一致，儀器也可以自動校正。成像結果如圖3 所示。

圖3 成像結果

3 結束語

組織切片免疫熒光染色及成像是研究組織形態和組織原位抗原表達非常重要的檢測手段，被廣泛應用于生物學研究和臨床病例診斷的各個領域。近年來，人們對于免疫熒光成像不僅僅局限在幾個樣品，或者是局部位置；而且更關注原位抗原表達在整個組織切片中的位置或者數量，這就需要研究者們運用大圖拼接的方式去對信號進行成像，即利用高倍鏡的高分辨率，又可以通過多張拍攝拼接起來獲得整體的組織圖像。因此，將高通量自動化拍攝和激光掃描共聚焦顯微鏡聯合起來，不僅利用激光掃描共聚焦顯微鏡獲得高分辨率、高信噪比的圖像，而且使用高通量的拍攝程序達到自動化、多樣品的目的。科研人員只需要將樣品放置于適配器上，以Z軸高度置于焦面附近，啟動程序即可完成拍攝任務。

經過多次測試，成年小鼠的脾臟，一次可完成20個樣品的全自動拍攝；小鼠腦片一次可完成40 個左右樣品的拍攝，因此高通量自動化拍攝彌補了現在商業化共聚焦無法離開人的短板，而這也是高端精密儀器的趨勢，盡量能自動化、智能化。讓公共平臺的儀器可達到7 d 24 h 全時段的運轉，從而釋放平臺的服務潛能，提高儀器的使用效率。另外，本研究編寫的拍攝程序只是針對多玻片的拍攝，后續可根據用戶需求增加圖像處理的程序。在拍攝完成之后，直接以Excel、散點圖、柱形圖等出示需要分析和統計的結果。該研究成果可以運用到大部分類似的激光掃描共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡上，對顯微鏡的配置要求是裝有Nis-elements AR 5.2版本以上的軟件，并包含HCA/Jobs模塊，顯微鏡主體型號為Nikon Ti-E 或者Nikon Ti2，希望可以給相關研究提供一定的借鑒和參考。