頭針電刺激對急性腦梗死大鼠神經膠質細胞及凋亡基因相關蛋白的影響*

王永盛 王蘋莉 程一升 趙元琛

（浙江省溫州市中西醫結合醫院，浙江 溫州 325000）

腦梗死是由腦血管阻塞引起的嚴重腦缺血缺氧性組織壞死疾病［1］。各種疾病和不良生活習慣可能導致腦梗死，如高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、血脂異常等，被證實與本病的高死亡率和致殘率呈正相關［2］。目前，對腦梗死的治療主要是溶栓和血栓清除，但治療效果不太理想［3］。因此，尋找有效的策略，以提高其腦梗死的治療效果成為研究的熱點。頭針電刺激是一種非藥物治療，可能對神經功能的恢復有促進作用［4］。一項薈萃分析表明頭針電刺激對腦梗死治療有積極作用，有助于腦梗死患者的綜合康復［5］。神經元細胞的加速凋亡是腦梗死的一個重要因素，其可能是由凋亡相關因素的調節引起的，如Caspase家族和B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族［6］。 動物研究表明，頭針電刺激可以通過抑制缺血腦的凋亡，對腦組織發揮保護作用［7］。雖然頭針電刺激對腦損傷具有抗凋亡和神經保護作用，但其抗凋亡作用機制尚不清楚。因此，本研究旨在觀察頭針電刺激對急性腦梗死大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和和Caspase-3表達的影響及神經膠質細胞的凋亡情況，為頭針電刺激治療腦梗死提供潛在的治療策略。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠45只，體質量220～260 g，由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SYXK（黑）2016-0009。

1.2 儀器與試劑 1）主要儀器：激光多普勒血流檢測儀（PE-5001，Sweden）購自上海永州實驗設備有限公司；光學生物學顯微鏡購自日本Nikon公司；臺式冷凍離心機Sorvall STR ATOS購自德國Heraeus公司；激光多普勒血流檢測儀（PE-5001，Sweden）購自上海永州實驗設備有限公司；凝膠成像儀購自美國UVP公司；BIO-RAD垂直電泳儀購自美國BIO-RAD公司；病理切片機、包埋機、脫水機購自德國Leica公司。2）主要試劑：三苯基四氮唑（TTC）購自美國Biosharp公司；水合氯醛購自上海上藥新亞藥業有限公司；蛋白抽提試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司 ；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.3 分組與造模 實驗前將大鼠置于SPF級環境中適應性喂養1周后進行實驗，動物相關處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。用隨機數字表法將SD大鼠均分為3組：假手術組、模型組和頭針電刺激組，假手術組15只，其余根據造模后再分，每組15只。每組用5只大鼠進行神經運動功能評分和TTC染色、5只進行血腦屏障通透性檢測、5只進行mRNA水平檢測。大鼠腦缺血再灌注損傷模型制備：采用線栓法制備動物大腦中動脈栓塞模型。大鼠禁食12 h后用10%水合氯醛（35 mg/kg）腹腔麻醉后，將大鼠仰臥于手術臺上，沿頸正中線行手術切口，充分暴露左側血管，分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，用激光多普勒血流檢測儀檢測左側大腦血流變化，待血流趨于平穩時，結扎頸外動脈遠端后，在頸外動脈上切開一個小切口，將一條尼龍線（直徑0.25 mm，尖端涂抹硅膠）插入頸內動脈約20 mm，并結扎，阻塞大腦血流。用生理鹽水清洗切口后逐層縫合。術后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續使用3 d。假手術組只切開皮膚和分離血管，不進行阻塞血流。剔除5只造模不成功大鼠。

1.4 干預方法 頭針電刺激組在造模成功后24 h根據《大鼠穴位圖譜》進行電針治療，大鼠仰臥于針刺臺上，用28號毫針刺激百會穴和大椎穴，進針2 mm后快速捻轉1 min后，接頻率1 Hz的脈沖電療儀，刺激時長每日1次，每次30 min，持續14 d。假手術組和模型組每天固定于針刺臺上30 min，不進行頭針電刺激，療程同頭針電刺激組。

1.5 標本采集與檢測 1）神經功能評分。根據Bederson′s 評分標準進行評分［8］，采用雙盲法，于造模后14 d后評價。2）TTC染色。做完功能評分的大鼠進行處死，取完整腦組織，行冠狀位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色。用Image Pro Plus 6.0軟件計算梗死體積。3）Western Blotting法檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達。實驗結束后，處死大鼠，取適量右側腦組織，用預冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，按1∶9加入蛋白抽提試劑，用超聲進行破碎，裂解15 min后離心后取上清，進行蛋白含量測定后調整蛋白濃度至一樣，加入1/5體積的5×Buffer進行變性，-80℃保存。進行電泳、孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統采集圖像并進行分析。4）TUNEL法檢測細胞凋亡。腦組織進行常規石蠟脫水、包埋、切片（2.0 μm），二甲苯脫蠟（2 次）、無水乙醇脫水 （2次）、95%和75%乙醇各洗一次，按TUNEL法檢測細胞凋亡說明書進行細胞凋亡檢測。使用熒光顯微鏡檢測凋亡細胞（綠色熒光染色），計數陽性細胞率。

2 結 果

2.1 各組大鼠腦梗死體積的比較 見表1，圖1。假手術組未見梗死灶，其余各組均出現不同程度梗死；與模型組相比，頭針電刺激組梗死體積明顯減小（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腦梗死體積的比較（%，±s）

表1 各組大鼠腦梗死體積的比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05。下同

組 別 n 大鼠腦梗死體積假手術組 5模型組 5 0 25.13±5.06頭針電刺激組 5 13.85±3.64*

圖1 各種大鼠腦梗死體積（TTC染色）

2.2 各組大鼠神經功能Bederson′s評分比較 見表2。假手術組大鼠表現正常；模型組出現不同程度的癱瘓側前肢回收屈曲腹下、病灶對側偏癱、爬行時向右劃圈和癱瘓后肢向后外展；給予頭針電刺激后，大鼠神經功能 Bederson′s評分降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠神經功能Bederson′s評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠神經功能Bederson′s評分比較（分，±s）

組 別 n Bederson′s評分假手術組 5模型組 5 0 3.02±0.41頭針電刺激組 5 2.13±0.24*

2.3 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比較 見表3，圖2。與假手術組相比，模型組和頭針電刺激組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3蛋白表達量均增加，Bcl-2蛋白表達量均降低（P＜0.05）；與模型組相比，頭針電刺激組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3蛋白表達量降低，Bcl-2蛋白表達量增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比較（±s）

與假手術組比較，△P＜0.05。下同

組 別 Bcl-2 Caspase-3假手術組 2.25±0.46 0.48±0.04 n Bax 5 0.30±0.03模型組 0.61±0.08△ 1.54±0.23△5 1.93±0.39△頭針電刺激組 5 0.86±0.27*△ 0.98±0.07*△ 0.88±0.24*△

圖2 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平的比較

2.4 各組大鼠腦組織中細胞凋亡率的比較 見表4，圖3。與假手術組相比，模型組和頭針電刺激組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，頭針電刺激組細胞凋亡率降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腦組織中細胞凋亡率比較（%，±s）

表4 各組大鼠腦組織中細胞凋亡率比較（%，±s）

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圖3 TUNEL染色結果（200倍）

3 討 論

頭針電刺激已被廣泛用于治療中風患者，能提高智力和記憶力，并刺激意識，改善患者認知功能［9］。一項對隨機對照試驗的系統綜述表明，頭針電刺激對腦血管性認知障礙患者的認知功能有積極作用［10］。同時，也有研究證實，頭針電刺激可以抑制細胞凋亡［11］。本研究結果表明，頭針電刺激能改善急性腦梗死大鼠神經功能，同時抑制神經膠質細胞的凋亡。本研究支持了頭針電刺激通過調控凋亡相關基因的表達來保護神經功能的觀點。

本研究的模型組神經膠質細胞凋亡增加，提示細胞凋亡與缺血后的神經元損傷有關。同時，用頭針電刺激干預后，神經膠質細胞凋亡數量明顯減少，說明頭針電刺激具有抗凋亡作用。然而，這種抗凋亡作用的機制尚不清楚。已知Bcl-2家族參與細胞凋亡調控，它由多種參與細胞凋亡調控的因子組成，如促凋亡因子Bax和Bak，以及Bcl-2和Bcl-xL等凋亡抑制因子，抗凋亡和促凋亡因子具有協同作用［12-13］。最近的研究表明，Bcl-2家族的調控受損進一步加重了缺血神經元的損傷，Bax和Bcl-2在腦組織中的平衡被打破［14］。電針能促進Bcl-2表達，同時抑制Bax的表達，使Bcl-2與Bax的比值增加，從而控制細胞凋亡，保護神經元不受損傷［15］。我們的結果與上述研究相一致。同時，Caspase家族在細胞凋亡過程中也發揮了重要作用，Caspase-3是公認的促進細胞凋亡的指標，其被激活，表示細胞進入不可逆階段［16］。本研究也證實了這一觀點。當然還有其他的因子也參與了細胞凋亡的發生，如STAT3，STAT3被磷酸化激活，從而抑制細胞凋亡，對其激活的抑制是腫瘤的潛在治療目標，如肝癌［17］。同時，STAT3激活可以促進Bcl家族中凋亡抑制因子的表達，有助于增強細胞的存活，其結果在鱗狀細胞癌中也得到證實［18］。 多種細胞因子（IL-6、TNF-α 等）也參與了細胞凋亡的調節，這些細胞因子在炎癥的發生發展過程中發揮了重要作用。腦梗死后都會出現不同程度的炎癥，這也證明這些細胞因子表達增加，使MAPK信號通路被激活，調控Bcl-2家族成員的表達，最終誘導了細胞凋亡［19］。由于本研究的限制，我們并沒有檢測STAT3、細胞因子、MAPK等的水平，只進行了凋亡相關蛋白的檢測。因此，我們推斷，頭針電刺激能激活Bcl-2，抑制Bax的表達，這可能是其發揮神經保護作用的潛在原因。同時，我們也必須注意一個問題，本研究使用的成年雄性大鼠，而老年人更容易發生腦梗死，而衰老的特征是大量的神經和生理改變。因此，頭針電刺激的實驗結果可能因年齡和/或性別而異，進一步的實驗和臨床試驗應該考慮到這一點。

綜上所述，頭針電刺激能改善急性腦梗死大鼠的神經功能，其機制可能與下調Bax和Caspase-3蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達，抑制神經膠質細胞凋亡有關。這些發現為頭針電刺激在急性腦梗死治療中的應用提供了理論依據，但頭針電刺激對腦梗死患者神經保護作用的相關分子機制尚須進一步探索。