益血方對急性腦梗死大鼠血管新生的作用及對促血管生成因子HIF-1α和Ang-2表達的影響*

張 芳張 波錢發(fā)才

（1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230061；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

腦梗死為臨床常見致殘和致死疾病，急性腦梗死為腦梗死常見類型，腦供血障礙和缺血缺氧造成腦組織壞死，系列神經癥狀，嚴重威脅生命健康，早期如何積極治療是目前面臨的重要問題［1-2］。急性腦梗死發(fā)病復雜，腦組織微血管與預后密切相關，目前臨床治療以抗血小板聚集、神經保護等對癥治療為主，臨床療效欠佳［3-4］。急性腦梗死屬中醫(yī)學“郁病”范疇，屬臨床常見的急危重癥，腦部血脈為患，腦之血脈受邪，引起臟腑、經絡生理功能失調，氣血瘀滯而為病，治宜生血補氣、疏肝解郁［5-6］。益血方由黃芪、當歸等組成，對急性腦梗死具有較好的臨床療效，但其對血管新生的作用機制尚不明確。本研究以急性腦梗死大鼠為模型，旨在探討益血方對急性腦梗死大鼠血管新生的作用機制及觀察其對促血管生成因子低氧誘導因子-1α（HIF-1α）和促血管生成素-2（Ang-2）表達的影響。現報告如上。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只SD大鼠，SPF級雄性，體質量（250±20） g，（25±2） ℃環(huán)境中 12 h 晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，自由飲水進食，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2017-0011。

1.2 試藥與儀器 益血方：黃芪15 g，當歸10 g，川芎10 g，赤芍 15 g，丹參 15 g，柴胡 10 g，補骨脂 10 g，菟絲子20 g，枸杞子20 g，銀杏葉 10 g，甘草10 g。 藥材均為筆者所在醫(yī)院中藥房提供，制成生藥含量1 g/mL的煎煮液。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）和白細胞介素-8（IL-8）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司），HIF-1α和Ang-2試劑盒 （碧云天生物科技有限公司），尼莫地平（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號：20170918），水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20171006）。切片刀和石蠟包埋機（浙江金華益迪試驗器材有限公司），手術器械（上海金鐘手術器械廠），低速離心機 （北京京立離心機有限公司），酶標儀（上海坤肯生物化工有限公司），顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 分組與造模 40只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、益血方組和陽性組各10只。模型組、益血方組和陽性組大鼠采用改良自身線栓法制備急性腦梗死大鼠模型。水合氯麻醉大鼠，俯臥固定于手術臺，剪開頸部右側旁正中淺筋膜，暴露右側頸總動脈和迷走神經，頓性分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，近心端結扎近端頸外動脈，微動脈夾住頸內動脈，0.3 mm尼龍線結扎固定頸總動脈，阻斷大腦中動脈起始端血流，頸內動脈根部固定，防止線栓移動，消毒縫合皮膚。對照組采用假手術，進行線栓。術后6 h可自由進食。

1.4 給藥方法 造模后第2天對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，益血方組給予益血方煎液灌胃，陽性組給予尼莫地平灌胃，劑量均為1 mL/kg，連續(xù)給藥7 d后進行觀察。

1.5 標本采集與檢測 1）敞箱試驗。給藥1周后采用敞箱實驗觀察大鼠行為，將大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm四壁涂黑紙板箱底面，下記錄3 min內大鼠正方形的數量、直立次數和修飾次數。2）腦組織病理組織觀察。眼球取血處死動物，取腦組織，生理鹽水清洗后，固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察。3）免疫熒光染色測量腦微血管數量。大鼠麻醉后心臟灌注，腦組織冰凍切片，CD31免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察微血管數量，選取皮層梗死灶周邊4個區(qū)域觀察。4）TTC染色法測量腦梗死面積。腦片平鋪于2%TTC染色液中，避光孵育0.5 h，10%甲醛固定，梗死組織而呈白色，正常腦組織呈紅色，通過Image-Pro Plus 6.0測量腦梗死面積。梗死百分比＝梗死區(qū)質量/（梗死區(qū)質量+非梗死區(qū)質量）×100%。5）TUNEL法檢測神經細胞凋亡情況。切片脫蠟脫水，TUNEL試劑盒反應液和復合液，DAB顯色，蘇木素復染并封片，觀察神經細胞凋亡情況。6）采集外周血，離心，取上清采用ELISA法測定外周血TNF-α、IL-2和IL-8細胞因子水平和HIF-1α和Ang-2水平，按說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以n（%）表示，進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組行為學評分比較 見表1。模型組水平、垂直和修飾次數評分均低于對照組，益血方組和陽性組水平、垂直和修飾次數行為學評分高于模型組 （P＜0.05），但益血方組和陽性組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組腦組織病理比較 見圖1。對照組腦組織正常，未見異常，益血方組梗死灶內細胞和血管壞死，神經元腫脹，間質水腫，益血方組和陽性組腦組織少數神經細胞死亡，水腫減輕，神經細胞腫脹減輕。

表1 各組行為學評分比較（分，±s）

表1 各組行為學評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n 修飾次數水平得分 垂直得分對照組 10 7.39±1.02模型組 10 2.53±0.96△益血方組 10 4.72±1.12*△15.01±1.43 80.26±6.24 6.75±1.06△ 29.17±5.62△11.74±1.52*△ 63.41±6.89*△陽性組 10 5.06±1.22*△12.51±1.38*△ 64.10±7.05*△

圖1 各組大鼠腦組織病理學切片（HE染色，200倍）

2.3 各組微血管密度、腦梗死百分比和神經細胞凋亡比較 見表2、圖2和圖3。對照組可見少量微血管，模型組微血管數量增多，益血方組和陽性組可見較多的微血管。模型組的微血管密度大于對照組，益血方組和陽性組微血管密度大于模型組（P<0.05），但益血方組和陽性組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組可見少量凋亡陽性細胞，模型組可見大量藍黑色陽性細胞多，凋亡陽性細胞主要分布于皮層區(qū)，益血方組和陽性組凋亡陽性細胞減少。模型組的腦梗死體積和神經細胞凋亡高于對照組，益血方組和陽性組腦梗死體積和神經細胞凋亡低于模型組（P<0.05），但益血方組和陽性組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠腦微血管變化（免疫熒光染色，400倍）

圖3 各組大鼠神經細胞凋亡TUNEL染色圖（200倍）

表2 各組微血管密度、腦梗死百分比和細胞凋亡比較（±s）

表2 各組微血管密度、腦梗死百分比和細胞凋亡比較（±s）

組 別 n 神經細胞凋亡（個）微血管密度（個）腦梗死百分比（%）對照組 10 12.34±2.67模型組 10 61.27±6.81△益血方組 10 31.51±5.47*△5.42±1.25 0.00±0.00 9.21±1.35△ 26.78±2.62△14.74±2.02*△ 18.12±1.89*△陽性組 10 32.64±5.31*△13.67±1.79*△ 17.90±2.05*△

2.4 各組血清炎癥因子水平比較 見表3。模型組血清TNF-α、IL-2和IL-8水平高于對照組，益血方組和陽性組血清TNF-α、IL-2和IL-8水平低于模型組（P<0.05），但益血方組和陽性組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組血清炎癥因子水平比較（ng/mL，±s）

表3 各組血清炎癥因子水平比較（ng/mL，±s）

組 別 n IL-8 TNF-α IL-2對照組 10 1.83±0.11模型組 10 4.57±0.27△益血方組 10 3.24±0.15*△34.17±4.91 3.51±0.21 65.42±6.42△ 5.84±0.42△46.38±5.33*△ 4.21±0.29*△陽性組 10 3.13±0.12*△45.13±5.41* 4.16±0.22*△

2.5 各組HIF-1α和Ang-2水平比較 見表4。模型組HIF-1α和Ang-2水平高于對照組，益血方組和陽性組HIF-1α和Ang-2水平高于模型組（P<0.05），但益血方組和陽性組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 各組 HIF-1α 和 Ang-2水平比較（ng/mL，±s）

表4 各組 HIF-1α 和 Ang-2水平比較（ng/mL，±s）

組 別 n HIF-1α Ang-2對照組 10模型組 10益血方組 10 14.36±2.67 12.14±11.31 46.37±3.42△ 40.14±24.22△21.56±2.33*△ 81.23±14.27*△陽性組 10 20.37±2.41*△ 80.65±14.11*△

3 討 論

血管新生為腦梗死神經功能修復的重要機制，新生血管可加速缺血區(qū)側支循環(huán)和組織營養(yǎng)物質的供給，改善局部血液供應，重塑受損腦組織結構，加速缺損神經功能修復［7］。HIF-1α為缺血缺氧調節(jié)因子，在缺氧條件下可調節(jié)多種基因，對急性腦梗死具有雙重作用。HIF-1α有α和β亞基組成，在急性腦梗死發(fā)病中促進側支循環(huán)生成，改善能量代謝，保護腦組織和神經細胞，在急性腦梗死治療中，HIF-1α降低梗死面積，促進血管生成和微循環(huán)的形成及腦缺血半暗帶細胞的功能，對中樞神經系統(tǒng)具有營養(yǎng)作用［8-9］。沈青等研究發(fā)現，HIF-1α參與了急性腦梗死疾病的發(fā)生發(fā)展過程，對疾病的嚴重程度和預后評估具有重要臨床價值［10］。血管新生可促進血管通透性增加，Ang-2表達在血管內皮細胞表面，為分泌型的細胞因子，Ang-2表達過高，引起血管功能收縮，Ang-2水平降低，減少腦血管的收縮或痙攣，改善急性腦梗死血供，與預后密切相關［11-12］。

中醫(yī)學認為急性腦梗死主癥為氣虛血瘀，治宜補氣活血。氣血之生成及血液暢行與五臟功能有關，益氣通脈使之平衡協(xié)調，促進血脈生成。現代醫(yī)家認為急性腦梗死為內因與外因共同結果，內因是發(fā)病基礎，外因是發(fā)病導火索，腦部血脈為患，腦之血脈受邪，導致血脈脆而不堅，肝陽上亢，痰氣引邪，氣血沖逆，血液瘀滯，上犯于腦，引起竅絡失利，氣血運行不暢［13］。中醫(yī)學中雖無血管新生的名稱，益氣活血類藥物使閉塞的血管再通。近年來中醫(yī)藥促進血管新生的研究較多，惠振等研究發(fā)現，復方通絡飲通過上調VEGF、Ang-1水平表達，促進腦梗死后微血管新生，對腦梗死大鼠具有保護作用［14］。馮容等發(fā)現龍蛭湯能促進氣虛血瘀證腦梗死大鼠急性期神經功能恢復和缺血腦組織血管新生，其機制與上調促血管生成因子、HIF-1α和Ang-2水平相關［15］。

本研究發(fā)現，益血方組水平、垂直和修飾次數行為學評分升高，腦組織少數神經細胞死亡，水腫減輕，神經細胞腫脹減輕，微血管密度增加，腦梗死體積和神經細胞凋亡；TNF-α、IL-2 和 IL-8 水平降低，HIF-1α 和Ang-2水平升高。這是因為益血方中黃芪具有補氣，活血通瘀的功效，當歸、川芎、赤芍、丹參等活血止痛，化瘀活血不傷血。黃芪和丹參均具有降低血液黏度、拮抗血小板聚集、改善微循環(huán)等功效，當歸能有效緩解缺血后再灌注損傷，其中含有的銀杏黃酮苷和銀杏內酯為強有力自由基清除劑，改善神經功能缺損，減輕缺血后腦水腫和炎癥，減少腦梗死面積［16-17］。綜上所述，益血方可改善急性腦梗死大鼠腦組織損傷，促進缺血腦組織血管新生，其機制可能與減輕炎癥反應，上調HIF-1α和Ang-2表達有關。