頭穴透刺法對急性期腦出血大鼠腦組織Beclin1和BNIP3L蛋白表達的影響*

鄒 偉 劉 鵬 于學平 戴曉紅 于婷婷

（黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

腦出血是指腦實質發生的非外傷性的出血性病變，具有高發病率、高死亡率的特點。我國是腦出血髙發國家之一，嚴重影響人們的生命健康和生活質量［1］。腦出血后線粒體功能障礙會引起繼發性腦損傷，導致細胞凋亡和壞死［2］。自噬也參與腦出血后的病理生理過程［3］，而線粒體自噬是一種靶向自噬，可以選擇性去除受損線粒體，減少腦的繼發性損傷。Beclin1作為自噬相關基因ATG6的哺乳動物同源體，主要參與自噬前體雙層膜結構的形成，可以誘導自噬發生和自噬泡形成［4］，它與LC3-B一樣均可作為自噬發生的標志性蛋白，Beclin1的表達水平能更好地反映自噬激活情況。BNIP3L參與介導線粒體自噬，在消除功能失調或過多的線粒體中扮演了重要的角色。目前頭穴透刺法已成為中醫治療急性腦出血的重要治療手段［5-6］，它是通過刺激腦不同的神經功能分區的方式，促進神經功能的恢復［7］。本研究應用自體血注射方法制備急性期腦出血模型，觀察Beclin1和BNIP3L的表達情況，闡述頭穴透刺法有可能通過影響急性期腦出血后的自噬水平而發揮神經保護作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇90只SD雄性大鼠，購自黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，其動物合格證號為SCXK（黑）2017-015，大鼠體質量 280～310 g。 飼養維持自然晝夜節律，自由飲食，室溫控制在（25±3）℃，空氣濕度為55%～60%。

1.2 試劑與儀器 腦立體定位（型號STW-3X，購于中國成都儀器廠），臺式牙鉆機（型號307-6，購于中國上海齒科醫械廠），石蠟包埋機（型號EG1150H，購于德國萊卡公司），石蠟切片機（型號RM2235，購于德國萊卡公司），兔抗Beclin1抗體（型號bs-1353R，購于中國博奧森公司），兔抗BNIP3L抗體（型號12396，購于美國Cell Signaling Technology公司），二抗山羊抗兔IgG（型號 ab7090，購于英國 Abcam 公司），3-MA（型號189490，購于美國CALBIOCHEM公司），免疫組化檢測試劑盒（型號PV-6001，購于北京中杉金橋生物技術公司），DBA顯色增強劑（型號ZLI-9034Z，購于北京中杉金橋生物技術公司），PBS緩沖液 （型號AR0030，購于武漢博士德生物工程有限公司），顯微攝影系統（型號BX43，購于日本OLYMPUS公司）。

1.3 分組與造模 大鼠隨機分為5組（假手術、模型組、3-MA組、針刺組、針刺組+3-MA組），再分為6 h、1 d和7 d等3個時間亞組，每亞組6只。腦出血模型采取自體血注射的方法［8］。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（60 mg/kg）進行麻醉、剃毛、消毒后將其固定于腦立體定位上，正中切長約1 cm口，暴露前囟及冠狀縫，取前囟點右旁開3.5 mm，后0.2 mm定點，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔［9］，距尾端3 cm處剪斷鼠尾取血50 μL，將微量注射器固定于立體定位儀上進針約6 mm后，將血液50 μL以25 μL/min速度推進尾殼核，留針約2 min后出針。術后封閉、縫合、消毒。造模6 h后，采用Longa評分法［10］對各組大鼠進行神經功能評分。評分＞0者判定為出現神經功能缺損體征，且處死后取腦證實顱內血腫者視為造模成功。

1.4 干預方法 假手術組操作步驟如上，但不注血；模型組操作步驟如上；針刺組參照 《實驗動物穴位圖譜》選取百會穴和曲鬢穴，以0.35 mm×40 mm針灸針快速刺入百會穴帽狀腱膜下，并向曲鬢穴透刺，進針深度大約1.5 cm。以150～180 r/min的速度進行捻轉，每日1次，每次留針30 min，期間捻轉刺激2次，每次持續5 min，每24小時進行1次，針刺操作均由同一針灸臨床醫師進行；3-MA組：在造模前30 min將自噬抑制劑3-MA［11］注射入側腦室；針刺+3-MA組：在 3-MA組的基礎上，采用同樣的針刺方法。

1.5 標本采集與檢測 1）神經功能評分。采用Bederson神經功能缺損體征評分［12］對大鼠進行神經功能測定。輕抓大鼠尾端，抬起高于桌面至20 cm，觀察大鼠四肢活動情況。2）免疫組化。大鼠在相應時間點神經功能評估后，使用10%水合氯醛過量麻醉，以注血點為中心前后各旁開3 mm處冠狀切開，將切下的6 mm厚度的大鼠腦組織塊，石蠟包埋，切片機切成厚度4 μm的組織片后脫蠟至水。室溫下在3%H2O2中孵育，PBS沖洗，切片入枸櫞酸鹽緩沖液。用PBS沖洗5 min，滴加一抗，過夜。滴加二抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗。DAB顯色5～10 min。蒸餾水沖洗。蘇木素復染1 min，水洗，脫水至二甲苯，中性樹膠封片，應用病理圖像分析系統對陽性細胞數的表達情況進行分析并拍照。

1.6 統計學處理 應用SPSS17統計軟件。神經功能評分和免疫組化結果應用單因素方差分析結合Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組Bederson神經功能缺損體征評分比較 見表1。造模前各組無神經功能缺損，各項評分均為0，造模后1 d組大鼠神經功能缺損最重，7 d時神經功能缺損體征明顯緩解。7 d時針刺組均較其他各組神經功能改善明顯（P＜0.05）。

表1 各組Bederson神經功能缺損體征評分比較（分，±s）

表1 各組Bederson神經功能缺損體征評分比較（分，±s）

與 3-MA 組比較，*P＜0.05；與針刺組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n 7 d假手術組 6 0.00±0.00模型組 6 1.45±0.21 3-MA 組 6 1.63±0.15△6 h 1 d 0.00±0.00 0.00±0.00 2.28±0.21 2.52±0.19 2.53±0.34△ 2.83±0.21△針刺組 6 0.86±0.08*2.33±0.22 2.59±0.13針刺+3-MA 組 6 2.48±0.26 2.75±0.25 1.56±0.23

2.2 各組Beclin1和BINP3L在腦組織陽性細胞表達比較 見表2～表3，圖1～圖2。3-MA組陽性細胞數表達最少，針刺組表達最多（P＜0.05），針刺組與模型組差異有統計學意義（P＜0.05），針刺組與針刺+3-MA組差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

腦出血后的病理損害主要包括物理損傷和血腫引起的腦原發性損傷［13］及由線粒體功能障礙、小膠質細胞活化、神經遞質、炎癥介質的釋放等所誘導的繼發性腦損傷。繼發性腦損害與腦出血后神經功能惡化和預后密切相關［2］。自噬在神經系統疾病中的作用是當今研究的熱點。但是，自噬在腦損傷后起到有益還是有害的作用仍存在爭議。線粒體自噬出現在蛛網膜下腔出血中，并起到保護神經組織免于蛛網膜下腔出血早期的凋亡、壞死性損傷［14］的作用。線粒體自噬是現在對細胞器選擇性自噬研究中認識最清楚的一種。線粒體可以為細胞提供能量、參與細胞的凋亡，因此細胞對損傷線粒體的清除至關重要，而損傷線粒體的清除依賴于線粒體自噬。

表2 各組腦組織Beclin1陽性細胞數結果比較（±s）

表2 各組腦組織Beclin1陽性細胞數結果比較（±s）

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表3 各組腦組織BINP3L陽性細胞數結果比較（±s）

表3 各組腦組織BINP3L陽性細胞數結果比較（±s）

組 別 n 7 d假手術組 6 24.83±1.47模型組 6 51.67±1.27*3-MA 組 6 19.50±3.53 6 h 1 d 16.33±0.72 17.00±0.63 26.33±1.73*33.17±0.75*7.17±0.95 9.67±1.21△針刺組 6 52.67±1.24 33.00±0.89 43.50±0.84針刺+3-MA 組 6 22.33±0.52△ 28.50±0.55 35.83±0.96△

圖1 7 d時各組大鼠腦組織Beclin1蛋白的表達（免疫組織化學法，400倍）

圖2 7 d時各組大鼠腦組織BNIP3L蛋白的表達（免疫組織化學法，400倍）

Beclin1主要參與自噬前體雙層膜結構的形成，其活性受PI3K的影響［13］，PI3K的催化亞基Vps34與Beclin1的特定結構域結合，導致磷脂酞肌醇磷酸化為磷脂酞肌醇-3-磷酸（PI3P），進一步促進自噬體雙層膜結構的合成，同時Beclin1還可與UVRAG基因和Bcl-2共同形成復合物來共同調控自噬過程［14］。BNIP3L是介導線粒體自噬的重要途徑之一。期初研究者把BNIP3L作為BH3-only蛋白研究其凋亡方面的作用，但發現其凋亡能力較弱［15］。Mclelland等的研究發現線粒體的程序性清除需要BNIP3L［16］。Novak的研究表明，BNIP3L有2個LIR序列，它可以通過LIR與LC3A等Atg8蛋白家族成員相互作用，進而誘導線粒體自噬。對BNIP3L同源蛋白BINP3的研究發現，其17與24位的色氨酸殘基的磷酸化可促進其與LC3B的相互作用［17］。Maiuri等的研究發現BH3-only蛋白可以與Beclin1競爭結合Bcl-2，從而釋放出游離的Beclin1，進而誘導自噬發生［18］。因此作為BH3-only蛋白的BNIP3L也可能通過這一機制誘導自噬。

《難經·四十七難》云“人頭者，諸陽之會也”，因而針刺頭部腧穴具有調節陰陽、疏通一身氣血的作用，而“百會”透刺“曲鬢”可以貫穿督脈、足太陽膀胱經和足少陽膽經，可以達到一針橫貫額、頂、顳三區的效果［19］。從20世紀90年代開始，頭針治療急性腦出血療效引起關注，頭穴透刺法是頭針的重要組成部分。我們的研究團隊在前期臨床研究中證實，頭穴透刺能明顯降低急性腦出血患者神經功能缺損程度評分，總有效率達91.67%［20］。其他研究者通過在臨床隨機對照實驗證實，頭針利于腦出血患者的血腫吸收和改善臨床神經功能缺損評分［21］。本次實驗在自體血注入的急性腦出血模型基礎上，采用神經功能評分法觀察頭穴透刺在腦出血急性期改善神經功能情況和免疫組化法對Beclin1和BNIP3L進行觀察，結果顯示假手術組，二者表達量均始終處于低水平表達狀態，且各時間點表達量并無顯著差異，而其他各組蛋白表達水平隨腦出血時間而升高，至7 d時最高，相同時間點內，針刺組表達量最高，而3-MA組最低，3-MA+針刺組的表達水平則處于模型組和3-MA組之間。由此可見，頭穴透刺法的刺激可以促使Beclin1和BNIP3L的表達量升高，使其對自噬體膜結構形成的催化作用增強，進而誘導自噬。3-MA抑制劑的使用則可以直接抑制PI3K活性，而阻礙自噬體的形成。Beclin1相對表達水平的降低則驗證了3-MA對自噬的抑制作用，在針刺效應和3-MA抑制劑的聯合作用下，蛋白的表達量仍高于單獨3-MA抑制劑組，進一步證實了頭穴透刺法可以通過對自噬的誘導來緩解3-MA對自噬的抑制作用，對腦出血大鼠腦組織細胞的具有保護作用，并且該結果與神經功能評分結果相一致。所以，頭穴透刺法可以改善急性期腦出血大鼠的神經功能可能是通過調節Beclin1和BNIP3L的表達有關。