蛇床子酸緩沖溫敏型凝膠的制備與體外評價*

李金玲，王亞靜，石惠姝，王亞楠，商利娜，趙海寧，張 怡，周夢楠

（天津中醫藥大學，現代中藥發現與制劑技術教育部工程研究中心，天津 301617）

老年性陰道炎是一種由于絕經后卵巢功能衰退、雌激素水平降低引發的婦女常見且多發的疾病，在絕經婦女中的發生率為26.1%～30.0%[1]，患者患處發炎、瘙癢、疼痛，嚴重影響生活質量。健康女性陰道呈適度弱酸性，而老年絕經婦女由于體內雌激素水平降低陰道上皮細胞內糖元減少，陰道內pH值增高，使酸性乳酸桿菌不再成為優勢菌，局部抵抗力降低，為致病菌提供了有利的生存環境[2-4]，菌群平衡失調最終導致致病菌感染，因此恢復和維持陰道酸性微環境，對重建陰道正常的微生物平衡起到重要作用。

中藥蛇床子具有殺蟲止癢、消炎鎮痛等藥理作用[5]，可減緩老年性陰道炎患者癥狀，現代藥理研究表明蛇床子中蛇床子素等主要成分還具有雌激素樣作用[6]，顯示出在老年性陰道炎防治中良好的應用前景。由于陰道的特殊生理結構和特點，不僅給藥不便且藥物往往難以抵達陰道深部、易于漏出、局部作用時間較短。溫敏凝膠作為一種環境敏感型智能凝膠，在貯存溫度下呈液態，注入體內響應給藥部位體溫變化發生相變，轉化成非化學交聯的半固體凝膠，不僅克服傳統陰道制劑鋪展性差、覆蓋率低的缺點，還具有延長藥物局部滯留時間、增加生物利用度[7]、減少給藥次數的應用潛力。本文以蛇床子提取物為模型藥物，制備具有酸緩沖功能的溫敏型中藥凝膠，并對其從膠凝溫度、膠凝時間、鋪展性、黏度、體外釋放等方面進行系統評價，為老年性陰道炎外用制劑的設計與開發提供參考。

1 材料與儀器

蛇床子提取濃縮液（自制，70%乙醇提取，濃縮至2 g生藥/mL）；泊洛沙姆 188（WPAK539B巴斯夫），泊洛沙姆 407（WPAK596B巴斯夫），甘油（1024C0314北京索萊寶），尼泊金乙酯（20180507安徽山河藥用輔料股份有限公司），PEG400（20180301北京鼎國生物技術有限責任公司），乳酸（H41022972北京索萊寶），乳酸鈉（20180428北京索萊寶），純化水（milip設備制備），甲醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純），乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；高效液相色譜儀（日本Shinadzu公司，SPD-20A紫外檢測器；LC-20T泵LCSolution色譜工作站），YP1001N電子天平（上海菁海儀器有限公司），PB-10 pH 測定儀（Sartorius），DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯儀器有限公司），全自動智能溶出儀（德國ERWEKA公司），干式恒溫器（杭州奧盛有限公司），DV-III型黏度計（美國Brookfield公司）

2 方法與結果

2.1 凝膠的制備 采用冷溶法制備溫敏凝膠[8]。量取純化水，加入2 g蛇床子提取濃縮液，在磁力攪拌下依次加入2 g PEG400，0.04 g尼泊金乙酯及處方量的酸緩沖溶液和溫敏基質，補加純化水至20 g，攪勻后于4℃冰箱中冷藏24 h，直至聚合物完全溶脹后即得。

2.2 評價指標

2.2.1 膠凝溫度 將液體溫敏凝膠置于0℃環境中，保證待測樣品擁有相同初始條件，取液體狀態的待測樣品，置于25℃干式恒溫器上預熱5 min后，以0.5℃/min的速率升溫至40℃，每升高0.5℃，觀察液體流動情況，容器倒轉凝膠不流動時的溫度即為膠凝溫度，平行測定3次，取均值。

2.2.2 鋪展性 參照文獻[9]分別測量膠凝前后的凝膠直徑，平行測定3次，取均值。

2.2.3 膠凝時間 將表面皿水浴加熱至37℃。取0.5 mL溫敏凝膠溶液于表面皿上方3 cm處進行推注，記錄溶液停止流動的時間，平行測定3次，取均值。

2.2.4 pH值及緩沖能力 采用pH計平行測定3次，取均值。以3 mL，1.4%NaHCO3溶液（pH為7.5）模擬老年性陰道炎患者陰道pH狀況[10]，緩沖能力以加入陰道模擬液后的pH值改變量來表示。

2.2.5 黏度測定 參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版四部旋轉黏度計測定法[5]采用DV-III型黏度計，64號轉子，轉速45 r/min，測量溫度為37℃，平行測定3次，取均值。

2.2.6 體外藥物釋放 色譜條件：色譜柱為ZORAX Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（65∶35），體積流量 1.0 mL/min，檢測波長322 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。參照《中國藥典》2015年版四部第二法槳法[5]測定溶出度。精密稱取蛇床子溫敏型凝膠1.0 g于透析袋中，以200 mL乳酸-乳酸鈉緩沖系統（pH=4）作為溶出介質，在（37±0.5）℃，轉速100 r/min條件下進行試驗，分別在0.5、4、12、30、36 h 取樣，用 0.22 μm 的微孔濾膜過濾，同時補充同溫新鮮介質，樣品按以上色譜條件測定峰面積，并計算累積釋放百分率。

2.3 酸緩沖體系的考察

2.3.1 緩沖能力的考察 稱取乳酸9.0 g，乳酸鈉18.8 g，加水至100 g，制得pH值為4的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液，分別取 0.1、0.3、0.6、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4 g，加水至20.0 g，分別加入3 mL陰道模擬液，按2.2.4項下方法測定其緩沖能力，結果見表1。由表可知，緩沖溶液用量在1.0～1.4 g時，其緩沖能力均能滿足維持pH值小于4.5。

表1 酸緩沖體系對緩沖能力的影響

2.3.2 對膠凝溫度的影響 分別取pH值為4的乳酸-乳酸鈉緩沖溶液 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4 g，按 2.1 項下方法制備泊洛沙姆407質量濃度為17%，泊洛沙姆188質量濃度為6%的溫敏凝膠，按2.2.1項下方法測定膠凝溫度，結果見圖1。由表可知，乳酸-乳酸鈉緩沖溶液的加入對溫敏凝膠的膠凝溫度有明顯的影響，且隨著乳酸-乳酸鈉緩沖溶液用量的增加，膠凝溫度呈現降低趨勢。

圖1 酸緩沖體系對膠凝溫度的影響

2.4 處方優化

2.4.1 D-最優混料實驗 以膠凝溫度為指標，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行最優混料設計，前期實驗已確定處方載藥量為5%，保濕劑PEG400為10%，防腐劑尼泊金乙酯為0.2%。因此，泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、緩沖溶液用量及純化水用量共占處方實際比例84.8%，根據預實驗結果設定其混料優選范圍為：泊洛沙姆 407（A）：14.0%～17.0%、泊洛沙姆 188（B）：0%～16.0%、酸緩沖體系（C）：5.0%～7.0%和純化水（D）：44.8%～65.8%。按2.1項下方法制備溫敏凝膠，按2.2.1項下方法測定膠凝溫度，結果見表2。

表2 混料設計實驗結果表

2.4.2 模型擬合分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，對各自變量和因變量的關系進行模型擬合，以擬合方程的擬合優度（R2）和置信度（P）作為模型判定標準，結果見表3，表中3次多項式擬合模型R2值最大，P值較低，模型擬合方程為Y=-4173.17X1+244.50X2+36.49X3+39.00X4+30 357.69X1X2+3 048.17X1X3+4 081.19X1X4-91.31X2X3-310.24X2X4-51.15X3X4-22 490.52X1X2X3-21 690.38X1X2X4+2574.64X1X3X4-119.40X2X3X4+59380.21X1X2（X1-X2）。根據最佳模型擬合方程，確定最優處方為5.0%蛇床子提取物、0.2%尼泊金乙酯、10.0%PEG400、16.4%泊洛沙姆407、5.2%泊洛沙姆188、5.6%酸緩沖體系、57.6%純化水。

表3 指標的回歸分析

2.5 體外評價

2.5.1 凝膠特性評價 以最優處方制備3批樣品，按2.2項下方法進行評價，結果見表4。

表4 蛇床子酸緩沖溫敏凝膠的質量評價

2.5.2 體外藥物釋放結果 按2.2.6項下方法測定溫敏凝膠在不同時間的累計釋放百分率，分別以零級方程，一級方程及Higuchi方程3種釋藥模型對蛇床子酸緩沖溫敏凝膠進行擬合，得到符合該曲線的方程，并用相關系數r判斷其擬合程度，以r最大為優，結果見表5。由表可知，蛇床子酸緩沖溫敏凝膠的體外釋放符合一級動力學模型，表明蛇床子酸緩沖溫敏凝膠具有良好的緩釋效果。

表5 蛇床子陰道酸緩沖溫敏凝膠體外釋放模型擬合結果

3 討論

健康女性陰道內乳酸桿菌可將陰道內剝落的上皮細胞中的糖元轉化為乳酸，使陰道pH值維持在3.5～4.5的正常范圍內，而老年性陰道炎患者由于病變陰道內pH值上升至7.5[11]，從而造成陰道微環境的改變，使得陰道優勢菌種乳酸桿菌逐漸減少，陰道菌群失調，局部抵抗力下降，為廣泛分布的體內外條件致病菌提供了入侵和大量繁殖的環境。本文以緩沖能力及膠凝溫度為指標對中藥蛇床子溫敏凝膠乳酸-乳酸鈉緩沖體系進行考察，確定了既滿足維持pH值小于4.5，又保持凝膠膠凝溫度在35℃的緩沖體系用量，該酸緩沖體系的建立有助于恢復和維持患者陰道酸性微環境，為陰道內優勢菌群提供良好的生存環境，進而重建陰道正常的微生物平衡，增加陰道抗病防御能力，對老年性陰道炎的防治具有積極作用。

本文以膠凝溫度作為考察指標，采用D-最優混料設計對處方優化并確定中藥蛇床子酸緩沖溫敏凝膠處方。所制得的凝膠在室溫下（25℃）呈液體狀態，黏度為（113.7±5.7）mPa/s，鋪展性良好，可保證藥物注入體內時與陰道褶皺充分接觸。在陰道溫度下轉化為膠凝狀態，膠凝時間為（2.4±0.4）s，黏度為（444.3±29.3）×104mPa/s，膠凝迅速、黏度增大可有效延長藥物局部滯留時間，提高藥物療效，此外體外藥物釋放符合一級動力學模型，表明該凝膠具有良好的緩釋作用，符合老年性陰道炎局部用藥的生理結構特點及用藥需求，為老年性陰道炎外用制劑的設計與開發提供參考。