基于金銀合金薄膜的高靈敏度寬光譜表面等離子體共振成像傳感器

梁爽，高然，張萌穎，薛寧，祁志美,＊

1中國科學院電子學研究所，傳感技術國家重點實驗室，北京 100190

2中國科學院大學，北京 100190

1 引言

表面等離子體共振成像(surface plasmon resonance imaging，SPRI)是一種消逝波傳感技術，主要用于對生化樣品進行原位實時非標記探測。SPRI在幾何光學上是一種棱鏡全反射光束成像，只不過入射光束在消逝場作用下與設置于棱鏡全反射面上的金、銀等貴金屬薄膜的表面等離激元(SPP)發生了共振耦合，使得反射光的強度、位相、或波長受到SPP的強烈調制，從而攜帶了關于薄膜表面的一些物理、化學信息，這些信息經圖像記錄和圖像解析可以被獲取和利用。SPRI不僅具有一定的二維空間分辨率，能夠同步檢測芯片表面不同位點的生化反應，而且具有較高的時間分辨率，能夠實時跟蹤不同位點的生化反應過程。自從 1987年Yeatman首次利用激光光源開展單色SPRI研究之后1，該技術在國際上引起了高度重視和廣泛研究，現已獲得商業化開發，并被應用于生物制藥、生命科學等多個領域2-6。單波長SPRI裝置通過在給定入射角下測量圖像灰度的變化完成生化樣品的檢測，動態檢測范圍較窄，一次成像難以反映成像區域所有位點的生化反應。Knobloch等人7于1996年首次利用白光光源獲得了SPR彩色圖像。相比于SPR灰度像，SPR彩色圖像包含波長信息，動態檢測范圍寬，原則上一次成像能夠提供整個成像區域所有位點的生化反應信息8-10。但是，如何從共振彩像中提取出只與波長相關的參數？這一關鍵問題直到 2006年才被香港學者Ho等人突破11。在此之前，彩色SPRI也只是用于直觀的圖像分析，不能進行定量檢測。Ho等人11將SPR彩像在HSV顏色空間12進行處理，得出共振彩像的色相(Hue)分布。色相只與決定圖像顏色的波長有關，而SPR彩像的顏色取決于共振波長，因此彩色SPRI能夠借助色相算法對待測物質進行定量檢測。我國對SPR傳感技術非常重視，研究單位較多，主要包括中國科學院電子學研究所和化學研究所，以及清華大學和深圳大學13-16。中國科學院化學研究所陳義課題組早在2007年就研制出了彩色SPRI裝置，但他們未對儀器的定量檢測功能進行開發和利用17,18。2017年本課題組將色相算法與寬光譜SPRI技術相結合，利用聚四氟乙烯涂覆的金膜傳感芯片，實現了對水中強致癌性苯并芘分子的原位圖像分析和定量檢測19,20，實驗驗證了傳感器基于二維色相分布的微觀尺度局域定量探測本領。

金膜SPRI傳感芯片化學穩定性好，但是檢測成本較高，靈敏度有限，不足以探測分子量低于200 Da的生化小分子21,22。銀膜SPRI傳感器雖然靈敏度高，但化學穩定性差23。為了克服現有SPRI傳感器的不足，本文成功研制出基于金銀合金薄膜的寬光譜 SPRI傳感器。金銀合金薄膜穩定性好，場增強因子高，能夠導致比金膜SPR傳感芯片更高的檢測靈敏度，有效降低檢測成本24-26。本文通過對金銀合金薄膜SPP共振波長和共振彩像進行同步測量，結合色相算法對共振彩像的處理，建立了共振彩像的色相值與共振波長的依賴關系，獲得了共振彩像的色相對表界面生化反應最為敏感的光譜區域。在此基礎上測試了金銀合金薄膜SPR彩像的色相對液體折射率的靈敏度和對牛血清蛋白(BSA)分子吸附的動態響應，并與金膜SPRI傳感器的折射率靈敏度進行了比較。

2 實驗部分

2.1 金銀合金薄膜SPR傳感芯片的制備

用于制備SPR傳感芯片的玻璃基底購自日本Matsunami Glass株式會社(厚度 0.9 mm，n =1.522@λ = 633 nm)，用于淀積金銀合金薄膜的濺射靶購自北京翠鉑林有色金屬技術開發中心有限公司，濺射靶由質量比為1 : 1的金銀合金制得。在制備SPR傳感芯片時，首先用丙酮、乙醇、Milli-Q超純水依次超聲清洗玻璃基片，基片被烘干后放入射頻濺射裝置的腔室內，首先經歷 3 min氧等離子體刻蝕以去除玻璃表面的吸附分子，然后在基片表面依次淀積3 nm鉻和50 nm厚的金銀合金薄膜，由此形成SPR傳感芯片。

2.2 實驗儀器的構建

設計制備了Kretschmann結構多功能平臺，該平臺能夠同步測試SPR共振光譜與共振圖像，其關鍵部件包括：LS-1型鹵鎢燈和 USB2000+光纖光譜儀購自美國 Ocean Optics公司，45°/45°/90°玻璃棱鏡(n = 1.799@λ = 633 nm)定制于北京北東光電自動化開發公司，彩色CCD數字成像模塊(XSXS192)購自深圳顯盛儀器有限公司，測角轉盤、光纖準直器和線性偏振片購自北京大恒光電技術公司，多模石英光纖來自浙江雷疇科技有限公司，用于注液的蠕動泵購自保定蘭格恒流泵有限公司，樣品槽及其夾具自制。

Kretschmann結構多功能平臺如圖1所示，玻璃棱鏡固定于測角轉盤上，SPR傳感芯片的玻璃基底一側與棱鏡底面通過折射率匹配液緊密貼合，金銀合金薄膜暴露于樣品槽內。鹵鎢燈發出的光依次通過多模石英光纖，光纖準直器及線性偏振片后成為p偏振平行光束(發散角小于0.2°)。平行光束以角度θ從棱鏡一斜面射入棱鏡，并在SPR傳感芯片的玻璃/金屬界面上發生全反射，全反射導致的消逝場在金銀合金薄膜表面激勵 SPP，使得從棱鏡另一斜面輸出的反射光受到 SPP的調制。反射光束射入顯微鏡筒后被筒內設置的半透半反鏡分為兩束光，其中一束光被CCD成像模塊接收進行SPP共振彩色圖像探測，另一束光經透鏡聚焦于光纖端面，由光纖輸入至光譜儀進行SPP共振光譜探測。SPP共振光譜探測的目的是為了建立共振彩像的色相參數與共振波長之間的依賴關系。

2.3 實驗方法

為了建立共振波長與共振彩像的平均色相之間的依賴關系，超純水被注入樣品槽內覆蓋金銀合金薄膜，將光譜儀積分時間設為50 ms，調節起始入射角θ，使得反射光度譜在580 nm附近出現SPP共振吸收谷，在此條件下采集反射光強度譜和SPP共振彩像。之后逐步手動調節入射角，每次調節使得共振波長紅移5 nm左右，在每次調節入射角前完成光譜和共振彩像的采集。從測得的反射光強度譜中得出SPP共振波長，利用色相算法從測得的SPP共振彩像中求出平均色相，然后將同一入射角下獲得的共振波長和平均色相組成數據對，建立兩者的對應關系。在本工作中，每一幅共振圖像的大小為300 × 300像素，對應的芯片面積約為0.5 mm2。

在折射率靈敏度測定實驗中，配制了質量分數分別為 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.5%和2%的氯化鈉水溶液。利用阿貝折射儀測得各溶液的折射率分別為 1.3330、1.3333、1.3337、1.3341、1.3346、1.3355和1.3364。測試時首先將超純水注入樣品槽，調節入射角θ = 12°，對應的起始共振波長約為595 nm，完成SPP共振光譜和共振彩像采集后將樣品槽中的超純水更換為給定濃度的氯化鈉水溶液，再次采集SPP共振光譜和共振彩像，由此得出各個 NaCl濃度對應的共振波長和圖像色相，進而獲得金銀合金薄膜SPR傳感器的共振波長和圖像色相對液體折射率的靈敏度。

圖1 寬光譜表面等離子體共振成像實驗平臺示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the laboratory-made spectral SPR imaging platform.

為了測試 SPRI傳感器對蛋白質吸附的圖像響應本領，利用超純水配制了濃度為10 μmol·L-1的牛血清蛋白(BSA)溶液作為待測樣品，在入射角θ = 12°的條件下采集完超純水對應的共振光譜及共振彩像后，再將BSA溶液注入樣品槽，以1 min的時間間隔陸續采集SPP共振光譜和共振彩像，30 min后結束測試。

3 結果與討論

3.1 共振波長與平均色相的依賴關系

圖2a顯示了在不同入射角度下測得的10個反射光強度譜，這些光譜被進行了歸一化處理。每一個光譜包含一個又深又窄的波谷，該波谷是由金銀合金薄膜SPP的共振吸收導致的，谷底對應的波長就是SPP共振波長。10個共振波長從λR=578.9 nm逐漸增大至λR= 629.9 nm，變化量為51 nm，圖 2b顯示了實驗記錄的 10個 SPP共振彩像，每一個彩像對應于圖2a中的一個光譜，可以看出共振彩像的顏色隨著共振波長的移動而變化。圖2b還給出了共振彩像經過色相算法處理得出的二維色相分布。每一個二維色相分布由300 ×300個色相值組成，也就是說共振彩像中的每一個像素點對應一個色相值，因此利用色相作為靈敏度參數，彩色SPRI傳感器能夠測量一個象素對應的局域靈敏度。求取這些色相值的平均值就獲得了整個共振彩像的平均色相。圖2c顯示了共振彩像的平均色相與共振波長的依賴關系。從圖中看出，平均色相值隨著共振波長的紅移呈非線性上升趨勢；在594.9-610.2 nm波長區間色相變化最快，由126.1線性增大至241.2，斜率為Δhue/Δλ =7.52 nm-1。這一斜率意味著以色相作為靈敏度參數，彩色SPRI傳感器的靈敏度比波長檢測型SPR傳感器高7.5倍。因此，將594.9-610.2 nm波長區間確定為色相敏感區間，可以使傳感器具有較高的色相靈敏度。值得強調的是，只要金銀合金薄膜SPR芯片參數給定，圖2c所示的平均色相與共振波長的曲線關系不隨芯片的更換而發生變化。該結論已經通過多次實驗測試得到確認。

3.2 金銀合金薄膜SPRI傳感器的折射率靈敏度

圖2 不同入射角度下測得的(a)共振光譜和(b)共振彩像以及共振彩像的二維色相分布；(c)共振彩像的平均色相值與共振波長的依賴關系Fig. 2 (a) Resonance spectra measured at different incident angles, (b) the corresponding resonance images and their 2D hue profiles; (c) relationship between the average hue and the resonance wavelength.

利用一系列濃度已知的 NaCl水溶液作為折射率液體，在入射角 θ = 12°下測試了 SPRI傳感器的共振波長和共振彩像的色相參數對液體折射率的靈敏度。圖3a所示的實驗結果為不同濃度氯化鈉溶液的SPP共振彩像及其對應的二維色相分布，圖中顯示，隨著NaCl水溶液質量分數從0%逐漸增加到2%，SPP共振彩像的顏色及對應的二維色相分布逐漸發生變化。圖3b顯示了共振彩像的平均色相值與溶液折射率的依賴關系。從圖中可以得到，隨著氯化鈉溶液折射率逐漸增加，SPP共振彩像的平均色相從126.45上升至231.78，二者呈良好的線性關系，擬合度R2= 0.993，直線斜率代表 SPRI傳感器的色相參數對溶液折射率的靈敏度。該靈敏度為 Δhue/Δnc= 29879 RIU-1(Refractive Index Unit)。為了比較，在相同實驗條件下測試了金膜 SPRI傳感器的平均色相對溶液折射率的靈敏度。設定起始共振波長約為590 nm，測得的靈敏僅為Δhue/Δnc= 3658 RIU-1，比金銀合金薄膜SPRI傳感器的靈敏度低8倍多。

圖3 (a)不同濃度NaCl水溶液覆蓋金銀合金薄膜后測得的共振彩像以及計算得到的各彩像的二維色相分布；(b)平均色相與NaCl溶液折射率的依賴關系Fig. 3 (a) Resonance color images and the corresponding 2D hue profiles (images obtained after covering the goldsilver alloy film with different concentrations of aqueous NaCl solutions); (b) relationship between average hue and refractive index of aqueous NaCl solution.

實驗還測試了金銀合金薄膜SPR芯片的共振波長對液體折射率的靈敏度，并與基于色相的折射率靈敏度作了比較。圖4a給出了在入射角θ =12°下測得的金銀合金薄膜SPR傳感器對NaCl溶液折射率的光譜響應結果。從圖中可知共振波谷隨著溶液折射率的增大逐漸紅移。如圖4b所示，共振波長與溶液折射率呈良好的線性關系，斜率為ΔλR/Δn = 3897.6 nm·RIU-1。該斜率即為傳感器對折射率的光譜靈敏度，它比實驗測得的基于色相的折射率靈敏度低7.67倍。這一比值與上述在色相敏感的光譜區間得到的直線斜率 Δhue/ΔλR=7.52 nm-1基本一致。

圖4 (a)不同濃度NaCl水溶液覆蓋金銀合金薄膜后測得的共振光譜，(b)共振波長與NaCl溶液折射率的依賴關系Fig. 4 (a) Resonance spectra measured after covering the gold-silver alloy film with different concentrations of aqueous NaCl solutions; (b) relationship between resonance wavelength and refractive index of aqueous NaCl solution.

為了分析金銀合金 SPRI傳感器在現有條件下是否具有單像素定量生化探測本領，圖5a給了由超純水更換為1% (w，質量分數)氯化鈉溶液所導致的共振圖像中每一個像素的色相變化量。從該三維圖中可以看出幾乎所有像素的色相值都增大了，整個圖像(300 × 300 像素)的平均色相變化量為47.2。但是不同的像素，其色相變化量不同，變化量最小為1.03，最大為135.43，離散度較大。進一步研究發現單像素點的色相與溶液折射率不滿足線性依賴關系，而且對于同一溶液折射率變化，單像素點的色相變化重復性較差，這就意味著在現有條件下，SPRI傳感器不具備單像素定量生化探測能力。通過分析數個至數十個像素的平均色相隨溶液折射率的變化，發現當像素點增大至6 × 6像素，其平均色相與溶液折射率呈較好的線性關系，如圖5b所示。上述分析結果指出在現有實驗條件下，金銀合金薄膜 SPRI傳感器能夠對6 × 6像素點所對應的微觀敏感區域進行定量生化探測。

圖5 (a)由溶液折射率變化導致的共振圖像中任意像素點的色相變化量，(b) 6 × 6像素點的平均色相隨溶液折射率的線性變化關系Fig. 5 (a) A change of hue at each pixel in the resonant image caused by a change in the refractive index of the solution, (b) The relationship between the average hue for 6 × 6 pixels and the solution index of refraction.

3.3 金銀合金薄膜SPRI傳感器對蛋白質分子吸附的響應

利用BSA水溶液作為被測樣品，驗證了SPRI傳感器對蛋白質分子非特異性吸附的定量檢測本領。首先利用阿貝折射儀對所配制的10 μmol·L-1的BSA溶液的折射率進行了測定，結果表明在測量精度范圍內溶液折射率與超純水折射率相同，從而排除了在測試過程中溶液折射率對傳感器響應的影響。圖 6a給出了在入射角 θ = 12°下，10 μmol·L-1BSA水溶液在吸附過程中的SPP共振彩像及其對應的二維色相分布。相比于直接觀測SPR彩像的顏色變化，通過色相算法計算得到的圖像二維色相分布可以更直觀的反映外界折射率的改變情況。圖6b給出了SPP共振彩像的平均色相隨蛋白質吸附時間的變化情況，吸附反應開始時，共振彩像的平均色相為128.45，隨著BSA分子在傳感芯片表面的吸附量逐漸增加，共振彩像的平均色相也在逐漸增加，當吸附進行20 min時平均色相不再隨時間變化，其穩定值為211.73。從吸附開始至吸附停止，色相的變化量為 Δhue =83.28。考慮到BSA分子在芯片表面的吸附最多只能形成一個完整的單分子層(即表面覆蓋度Γ = 1)，而在現有條件下 SPRI傳感器的平均色相測量誤差約為σ = 4，按照3σ準則，傳感器能夠測得的BSA最小表面覆蓋度近似為0.14。

圖6 (a)在BSA吸附過程中測得的共振彩像以及彩像的二維色相分布，(b)共振彩像的平均色相與吸附時間的依賴關系Fig. 6 (a) SPR images corresponding to different adsorption time and two-dimensional hue profiles corresponding to different SPR images; (b) average hue versus adsorption time.

4 結論

本文報道的一種基于彩色圖像色相算法的寬光譜SPRI生化傳感器，它使用金銀合金薄膜制作SPR傳感芯片，具有時間分辨的圖像分析和微觀區域定量檢測本領。與傳統的金膜SPRI傳感器相比，金銀合金薄膜 SPRI傳感器具有檢測靈敏度高、檢測成本低的優點。通過實驗測試，建立了金銀合金薄膜SPP共振彩像的平均色相與SPP共振波長的依賴關系，確定了色相敏感的光譜區間為594.93-610.16 nm。實驗獲得了金銀合金薄膜SPRI傳感器的平均色相對液體折射率的靈敏度為29879 RIU-1，比基于共振波長的折射率靈敏度高7.5倍，并且顯著高于傳統的金膜SPRI傳感器的平均色相對液體折射率的靈敏度。本文進一步實驗驗證了金銀合金薄膜 SPRI傳感器適用于對蛋白質分子吸附過程的原位動態檢測，能夠對表面覆蓋度小于5%的BSA吸附分子作出明顯響應。本文研究結果指出這種基于金銀合金薄膜的寬光譜SPRI傳感器在生化物質的原位非標記檢測中具有良好的應用前景。