綠升麻中黃酮類成分的純化與含量測定研究

孫偉健，于 野

(長春東方職業學院，吉林 長春 130000)

綠升麻，為毛茛科植物類葉升麻的根莖。具有散風熱，祛風濕等功效[1]。研究表明黃酮類物質具有較強的生理活性，且無毒無害，具有抗癌、抗腫瘤、抗炎鎮痛等作用[2]。據文獻報道，綠升麻屬植物植株各部分均含有黃酮類化合物，并為本屬植物最主要的化學成分[3]。采用超聲波法提取綠升麻中的黃酮，因為索氏提取植物的有效成分，操作簡便快捷、提取率高、速度快、提取物的結構未被破壞、效果好[4]。大孔吸附樹脂吸附分離技術是采用大孔樹脂從中藥中選擇性吸附目標成分、分離其它成分的一種綠色與節能技術，具有選擇性好、吸附容量大、再生處理方便、操作簡單等優點[5-6]。本實驗選用AB-8型大孔吸附樹脂對提取物進行了純化。

1 儀器與材料

SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化學儀器廠)；Agilent-1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；FA2004電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)；有機溶劑為國藥集團上海試劑廠產品，其它試劑為分析純。

蘆丁、槲皮素、芹菜素標準品(中國食品藥品檢定研究院)。

2 提取與分離

稱取90 g綠升麻粉末，甲醇浸泡24 h，溫度40℃，索氏提取4 h，將提取液合并，冷卻，蒸餾，得浸膏3.4838 g。浸膏甲醇溶解，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到4種萃取物。

采用濕法裝柱，乙醇為洗脫劑。加入1 g浸膏的醇溶液，用30%、40%、45%、70%乙醇梯度洗脫，得粉末狀樣品0.0988 g。

取蘆丁，槲皮素，芹菜素標準品，精密稱定10 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量甲醇，得對照品溶液。精密稱取干燥的樣品粉末10 mg，三份，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得待測溶液。

色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm ID，5 μm)及保護(12.5 mm×4.6 mm ID，5 μm)流動相為色譜級乙腈和0.4%的磷酸水溶液，比例為13:87；流速1 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。根據色譜條件繪制譜圖。結果見圖1～3。

分別取配制好的對照品溶液0.5、0.75、1.0、1.25、1.5mL，分別置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，制成系列混合對照品溶液。以濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，求出線性回歸方程，繪制標準曲線。

精密量取蘆丁，槲皮素，芹菜素樣品適量。置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，濃度分別為1.0、0.5、0.5 mg/mL，取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL于10 mL容量瓶中定容，按上述色譜條件測定峰面積，根據標準曲線計算黃酮的含量。

3 結果與討論

3.1 最佳的純化洗脫條件

研究發現，乙酸乙酯層黃酮的含量最高，三倍量體積的萃取效果最好。使用AB-8型大孔吸附樹脂純化，用不同濃度的乙醇洗脫黃酮后，70%的乙醇洗脫的黃酮最多。

夫妻倆當然也有不同的地方，張允和是“詩化的人”，富于傳統文化韻味，周有光則是“科學的人”，條理明晰，滔滔善辯。性格不同，并不相互抵觸，而是相互補充，以音樂為例，他跟著她去聽昆曲，她則跟著她一起聽西洋音樂。

3.2 高效液相色譜法含量測定的結果

3.2.1 標準品測定圖譜

圖1 氯仿層中黃酮含量的高效液相色譜圖

圖2 乙酸乙酯層中黃酮含量的高效液相色譜圖

圖3 正丁醇中黃酮含量的高效液相色譜圖

3.2.2 標準曲線制備的結果

表1 綠升麻中的黃酮成分線性回歸方程

用HPLC法在波長320 nm處測定，進行一元線性回歸，得回歸方程見表1。

蘆丁在62.5～1000 g·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系，芹菜素在31.25～0.5 g·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系，槲皮素在31.25～0.5 g·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系，工作曲線結果見表2。

表2 蘆丁、槲皮素、芹菜素工作曲線測定結果

3.2.3 精密度試驗的結果

準確量取同一質量濃度的供試液連續測定5次，測定峰面積，結果：蘆丁RSD=0.16 %，槲皮素RSD=0.12%，芹菜素RSD=0.39%(n=5)，表明精密度良好。詳細結果見表3。

表3 芹菜素、蘆丁、槲皮素精密度試驗結果

3.2.4 重現性試驗的結果

取供試品溶液中的樣品5份，按照上述色譜條件操作，含量測定結果見表4。

表4 蘆丁、槲皮素、芹菜素重復性試驗結果 (n=5)

計算得RSD為0.06%(n=5)。測定結果顯示，本試驗測定方法的槲皮素含量重復性良好。

計算RSD為0.06%(n=5)。測定結果顯示,本試驗測定方法的芹菜素含量重復性良好。

3.2.5 穩定度試驗的結果

取同一供試液，在相同的色譜條件下分別在0,1,2,3,4,5 h按上述色譜條件測定峰面積(見表5)，蘆丁RSD值為0.16%，槲皮素RSD值為0.15%，芹菜素RSD值為0.36%，符合有關規定。

表5 蘆丁、槲皮素、芹菜素穩定度試驗結果表

3.2.6 樣品含量測定的結果

由標準曲線計算含量。純化前綠升麻中蘆丁含量為1.5%，槲皮素含量為1.3%，芹菜素的含量為1.0%。純化后樣品中氯仿層中的黃酮類成分含量在81.7%，乙酸乙酯層中的黃酮類成分含量在97%，正丁醇中黃酮類成分的含量在84.6%。