微生物發酵技術同步提取青錢柳多糖和黃酮

魯青，嚴美婷，張超鳳，張良

(江西省食品發酵研究所，江西 宜春，336000)

青錢柳是一種我國獨有的、重點保護的珍稀樹種，主要分布于江西、浙江等地[1-2]。研究表明，青錢柳含有多種有機活性物質，如多糖、黃酮及三萜類等[3]，具有降血糖血脂、抗腫瘤、抗氧化、保肝護肝等多種功效，其中多糖和黃酮是其主要的功效成分之一[4-9]。目前青錢柳多糖及黃酮的提取多采用熱水浸提法、微波提取法和超聲波提取法等[10-12]，但提取率不高，且提取工藝只對多糖和黃酮進行單獨提取，易造成原料的浪費。而采用微生物發酵技術，利用微生物對青錢柳葉進行發酵，破壞柳葉的細胞壁，使細胞中的多糖及黃酮較大程度地同步溶出，即可達到同步高效提取多糖和黃酮的目的。

本研究采用微生物發酵技術對青錢柳多糖和黃酮進行同步提取，優化提取工藝，以得到一種經濟有效、同步快速提取青錢柳多糖和黃酮的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳葉，采自江西修水縣；纖維素酶(酶活力100 000 U/g)、半纖維素(酶活力50 000 U/g)，和氏璧生物科技有限公司；黑曲霉 CICC 2041、枯草芽孢桿菌 CICC 10023，由江西省食品發酵研究所微生物實驗室提供；蘆丁(99.8%)、葡萄糖(99.6%)，北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司；甲醇、石油醚、無水乙醇、苯酚、硫酸，西隴化工股份有限公司；AlCl3(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SP-756PC紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；ML204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司；QYC-2102搖床，上海新苗醫療器械制造有限公司；LDZF-75KB高壓滅菌鍋、GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱，上海申安醫療器械廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝

青錢柳葉干燥、粉碎→酶解→高溫滅菌→接種→發酵提取→過濾→測定

↑ ↑

纖維素酶、半纖維素酶 黑曲霉、枯草芽孢桿菌

1.3.2 菌種活化

將黑曲霉接入馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基中，在28 ℃、150 r/min 培養36 h制成黑曲霉種子液；將枯草芽孢桿菌接入營養肉湯培養基中，35 ℃、150 r/min培養18 h，制成枯草芽孢桿菌種子液。

1.3.3 青錢柳多糖和黃酮同步提取工藝優化

1.3.3.1 料液比的選擇

稱取適量青錢柳葉粉末，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)添加水，然后加入0.4%纖維素-半纖維素酶(2∶1，m/m)復合酶，于55 ℃水浴加熱酶解3 h后添加6%蔗糖，繼而115 ℃滅菌20 min，冷卻后以4%接種量接入菌種比為1∶3的黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，于150 r/min、30 ℃發酵提取1.5 d。測定發酵液中多糖及黃酮提取率，以確定最佳料液比。

1.3.3.2 酶添加量的選擇

在最佳料液比條件下，分別添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的復合酶酶解青錢柳葉，其他條件保持不變，發酵提取多糖和黃酮，測定發酵液中多糖及黃酮提取率，確定復合酶添加量。

1.3.3.3 菌種比例的選擇

選擇最佳料液比和酶添加量，其他條件不變，分別考察黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合比為1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1對青錢柳葉發酵提取多糖和黃酮的影響，確定菌種比例。

1.3.3.4 接種量的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，分別以3%、4%、5%、6%、7%的接種量接入黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，于150 r/min、30 ℃發酵提取1.5 d。測定發酵液中多糖及黃酮提取率，確定接種量。

1.3.3.5 轉數的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，以4%接種量接入黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，分別以130、140、150、160、170 r/min于30 ℃發酵提取1.5 d。測定發酵液中多糖及黃酮提取率，確定轉數。

1.3.3.6 溫度的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，以4%接種量接入混合菌種子液，分別在22、26、30、34、38 ℃溫度下以150 r/min發酵提取1.5 d。測定發酵液中多糖及黃酮提取率，確定發酵溫度。

1.3.3.7 時間的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，以4%接種量接入混合菌種子液，于150 r/min、30 ℃分別發酵提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 d。測定發酵液中多糖及黃酮提取率，確定發酵時間。

1.3.3.8 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取對青錢柳多糖及黃酮提取率影響較大的接種量、溫度和時間3個因素進行正交試驗，以多糖和黃酮的提取率為指標，得到優化的同步提取工藝。因素水平如表1。

1.3.4 多糖和黃酮提取率的測定

多糖采用苯酚-硫酸法測定[13-15]；黃酮采用紫外分光光度法測定[16-17]。

(1)

(2)

表1 青錢柳多糖和黃酮同步提取因素水平表Table 1 Factors and levels of the synchronous extractingCyclocarya paliurus polysaccharides and flavonoids

1.4 數據處理

每個試驗做3個平行，結果取平均值，并采用DPS v6.55和Excel 2007 軟件處理分析試驗數據。

2 結果與分析

2.1 料液比對多糖和黃酮提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增大，多糖和黃酮的提取率均隨之增加，這是由于隨著料液比增大，物料與溶液間的濃度差增大[18]，同時微生物的發酵作用也增強，使得青錢柳葉中的多糖和黃酮更易溶出。當料液比為1∶20時，兩者的提取率達到最大，繼續增大料液比，提取率基本趨于穩定。故選擇1∶20為最佳料液比。

圖1 料液比對多糖和黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ratio of solid and liquid on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.2 酶添加量對多糖和黃酮提取率的影響

由圖2可知，當酶添加量為0.4%時，青錢柳多糖和黃酮的提取率達到最高，分別為5.03%和4.67%，繼續增大酶添加量，提取率基本無變化，說明0.4%的酶量足以酶解青錢柳葉的細胞壁，使多糖和黃酮溶出。故最佳的酶添加量為0.4%。

圖2 酶添加量對多糖和黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.3 菌種比例對多糖和黃酮提取率的影響

不同的菌種比例對青錢柳多糖及黃酮的發酵提取效果不同，由圖3可知，黑曲霉與枯草芽孢桿菌的比例為1∶2時，多糖及黃酮的提取率最高，分別達5.28%和5.04%，說明此比例下兩種菌通過發酵作用對青錢柳葉細胞壁的破壞作用最強，最有利于多糖和黃酮的溶出。故最適的菌種比為1∶2。

圖3 菌種比例對多糖和黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of the ratio of strain on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.4 接種量對多糖和黃酮提取率的影響

由圖4可知，接種量低于5%時，多糖及黃酮的提取率隨著接種量的增加而增加，這是由于接種量加大，微生物增長較快，發酵提取時間減短，多糖和黃酮隨著微生物的發酵從青錢柳葉中溶出。接種量為5%時，提取率達到最大，分別為5.92%和6.11%，但繼續增大接種量，兩種物質的提取率均下降，可能是由于微生物數量過多，導致多糖和黃酮被分解利用，使得含量減少[19]。故最佳接種量為5%。

圖4 接種量對多糖和黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of inoculation size on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.5 轉速對多糖和黃酮提取率的影響

不同的轉速對青錢柳發酵提取多糖和黃酮的效果不同，由圖5可知，隨著發酵轉速的增大，多糖和黃酮的提取率先增加后減少，轉速為160 r/min時，兩種物質的提取率最高，分別為5.57%和5.21%。轉速大于160 r/min時，由于轉速過大，剪切力大，易導致微生物細胞破裂死亡，不利于菌體的生長代謝，使得對青錢柳葉的發酵作用減弱，進而導致多糖和黃酮的提取率降低。故最適轉速為160 r/min。

圖5 轉速對多糖和黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of shaking speed on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.6 溫度對多糖和黃酮提取率的影響

溫度對微生物的生長代謝有重要影響，它會影響菌體細胞內酶的活性及蛋白質等物質的合成[20]，從而影響青錢柳多糖及黃酮的發酵提取產量。

圖6 溫度對多糖和黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

由圖6可知，多糖和黃酮的提取率隨著發酵溫度的升高而先增加后降低，30 ℃時兩種物質的提取率達到最高。溫度過低，黑曲霉和枯草芽孢桿菌生長緩慢，溫度過高，黑曲霉活性降低，生長代謝能力下降，因此過高或過低的溫度均不利于微生物的發酵作用，故最佳溫度定為30 ℃。

2.7 時間對多糖和黃酮提取率的影響

由圖7可知，發酵時間對多糖和黃酮的提取率影響較大，發酵2 d，多糖及黃酮的提取率最高，分別達6.17%和6.09%。低于2 d時，2種物質的提取率均隨著時間的增加而增加，這是由于多糖和黃酮隨著微生物的發酵而逐漸被溶出，繼續延長發酵時間，兩種物質的提取率反而下降，可能是由于發酵液中的營養物質被耗盡導致菌種的發酵能力減弱，以及已溶出的多糖和黃酮被分解利用。因此最佳的發酵時間為2 d。

圖7 發酵時間對多糖和黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of time on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.8 正交優化試驗結果

對正交試驗所得數據進行分析處理，正交試驗結果見表2，多糖提取率方差分析結果見表3，黃酮提取率方差分析結果見表4。

表2 正交優化試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments

由表2極差分析結果可知，影響多糖提取率的主次因素依次為接種量>時間>溫度，影響黃酮提取率的主次因素依次為溫度>接種量>時間，通過直觀分析初步得到對于多糖的提取率而言較佳方案為A2B3C2，對于黃酮的提取率而言較佳方案為A2B2C2。

表3 多糖提取率方差分析結果
Table 3 Variance analysis of polysaccharides extractionyield

變異來源平方和自由度圴方F值P值顯著性A(接種量)2.699821.349967.456 40.014 6?B(溫度)0.396420.19829.905 10.091 7C(時間)1.146320.573128.641 30.033 7?誤差0.040020.0200

注：**表示P<0.01，差異極顯著；*表示0.01

表4 黃酮提取率方差分析結果
Table 4 Variance analysis of flavonoids extraction yield

變異來源平方和自由度圴方F值P值顯著性A(接種量)0.925 120.462 522.961 40.041 7?B(溫度)1.470 420.735 236.497 00.026 7?C(時間)0.035120.0175 00.870 90.534 5誤差0.040 320.020 1

由表3和表4方差分析結果可知，接種量對青錢柳多糖及黃酮提取率的影響均顯著，溫度對多糖提取率的影響不顯著，而對黃酮提取率的影響顯著，發酵時間對多糖提取率的影響顯著，而對黃酮提取率的影響不顯著。故綜合考慮多糖及黃酮提取率的極差分析和方差分析結果，可得出多糖及黃酮同步提取的最佳方案為A2B2C2。經驗證采用此方案發酵提取青錢柳多糖和黃酮，兩種物質的提取率分別達7.57%和6.98%，因此青錢柳多糖及黃酮同步提取的最佳工藝為接種量5.0%、發酵溫度為30 ℃、發酵時間2 d。

3 結論

采用微生物發酵技術對青錢柳多糖和黃酮進行同步提取，通過單因素及正交試驗優化了多糖和黃酮的同步提取工藝，得到最佳提取工藝為：青錢柳葉以1∶20的料液比與水混勻，添加0.4%的纖維素酶-半纖維素酶復合酶進行酶解，再按照5.0%接種量接入菌種比為1∶2的黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，于160 r/min、30 ℃發酵提取2 d，最終得到青錢柳多糖的提取率達7.57%，黃酮的提取率達6.98%，遠高于XIE等[21]采用超聲波提取法提取青錢柳多糖(得率為4.91%)和郝翻[22]采用有機溶劑提取法提取青錢柳黃酮(得率為3.055%)，極大提高了青錢柳多糖和黃酮的提取率及原料的利用率。