復(fù)配發(fā)酵劑對(duì)羊肉發(fā)酵香腸脂肪氧化及脂肪酸組成的影響

韓云飛，翟鈺佳，郭駿飛，楊樂(lè)，德力格爾吉日嘎拉，段艷

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

發(fā)酵香腸是指將碎肉和丁狀脂肪同鹽、糖、香辛料等混合灌入腸衣內(nèi)，經(jīng)微生物發(fā)酵及干燥成熟而制成的肉制品[1]。傳統(tǒng)香腸的自然發(fā)酵完全依靠本身少量的微生物，存在發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)品質(zhì)量難以保障等缺點(diǎn)，因此逐漸被人工接種發(fā)酵劑所取代。目前常用的肉制品發(fā)酵劑有葡萄球菌、微球菌和乳酸菌[2-3]。葡萄球菌可釋放脂肪酶和蛋白酶，增強(qiáng)肉制品風(fēng)味，產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶，改善產(chǎn)品色澤[4-6]。JEONG等從豆制發(fā)酵食品中篩選出33株葡萄球菌,大多數(shù)可在4% NaCl的條件下顯示脂肪酶活性[7]。高繼慶等發(fā)現(xiàn)添加了木糖葡萄球菌的魚類，脂肪氧化產(chǎn)物含量增多[8]。乳酸菌具有產(chǎn)酸速度快、耐鹽、抑菌等特點(diǎn)[9-10]，可縮短發(fā)酵周期，提高食品安全性。為滿足發(fā)酵香腸品質(zhì)、成本、安全性等要求，葡萄球菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵劑的使用越來(lái)越多。FIEIRA等將葡萄球菌與乳酸菌作為發(fā)酵劑用于意大利香腸，研究NaCl替代物對(duì)發(fā)酵劑的影響[11]，可見葡萄球菌和乳酸菌作為混合發(fā)酵劑的實(shí)用性很強(qiáng)。SUN等將葡萄球菌與乳酸桿菌混合用于哈爾濱香腸，發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵劑改善了肉制品品質(zhì)[12]。

脂肪氧化是發(fā)酵香腸成熟過(guò)程中主要的生化反應(yīng)之一，可將脂肪分解產(chǎn)生的脂肪酸進(jìn)一步氧化為醛酮等風(fēng)味物質(zhì)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵肉制品60%的風(fēng)味來(lái)源于脂肪分解、氧化[13]。本實(shí)驗(yàn)將從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)肉制品中分離篩選出具有脂肪分解能力的木糖葡萄球菌X21-2m與植物乳桿菌19-2D復(fù)配應(yīng)用于羊肉發(fā)酵香腸，以自然發(fā)酵和漢森發(fā)酵劑作為對(duì)照，研究其對(duì)羊肉發(fā)酵香腸脂肪氧化和脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原輔料：精選內(nèi)蒙古市售蘇尼特羊后腿肉和羊尾肥膘。食鹽、蔗糖、葡萄糖、孜然粉、黑胡椒粉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、天然豬腸衣。

發(fā)酵劑：木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)X21-2m及植物乳桿菌(Lactobacillesplantarum)X19-2D均為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品實(shí)驗(yàn)室保藏。漢森發(fā)酵劑：木糖葡萄球菌和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

試劑：異丙醇、乙醚,天津市富宇精細(xì)化工公司；冰乙酸,天津市永晟精細(xì)化工公司；氯仿、甲醇,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；正己烷(色譜純),天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；所有分離用有機(jī)溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HN200氮吹儀，海能儀器；AM204電子天平，梅特勒-托利多儀器公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州國(guó)華電器公司；通風(fēng)櫥、SC-3612低速離心機(jī)、Clarns680氣相色譜儀、JC-HW-2旋渦振蕩器，濟(jì)南精誠(chéng)試驗(yàn)儀器公司；TCP全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)，北京奧依克光電儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵香腸的制備

1.3.1.1 工藝配方

精選羊后腿肉(占量80%)，去筋；羊尾肥膘(占量20%)。輔料主要為葡萄糖0.5%、食鹽2.5%、蔗糖0.5%、孜然粉0.5%、黑胡椒粉0.5%、亞硝酸鈉70 mg/kg、硝酸鈉100 mg/kg。

1.3.1.2 發(fā)酵香腸的制備

輔料、發(fā)酵劑

↓

原料肉→瘦肉絞碎、肥肉切丁→攪拌制餡→低溫腌制(4 ℃，12 h)→灌腸→發(fā)酵(24 ～25 ℃，RH 98%～95%，3 d)→干燥成熟(14～15 ℃，RH 90%～65%，11d)→真空包裝→成品

分組：自然組(未添加發(fā)酵劑)；漢森組(添加科·漢森發(fā)酵劑，0.125 g/kg)；復(fù)配組(添加木糖葡萄球菌X21-2m與植物乳桿菌X19-2D 2∶1的混合菌株，107CFU/g)。

1.3.1.3 樣品的采集

分別于香腸加工過(guò)程中發(fā)酵結(jié)束(3 d)、加工結(jié)束(11 d)、貯藏(4 ℃真空)1周(18 d)、2周(25 d)、貯藏第1個(gè)月(41 d)、2個(gè)月(71 d)、5個(gè)月(161 d)各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取樣品，用于香腸各指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 脂肪氧化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 酸價(jià)(acid value，AV)的測(cè)定

參照GB 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.3.2.2 過(guò)氧化值(peroxide value，POV)的測(cè)定

參照GB 5009.227—2016《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[15]。

1.3.2.3 硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的測(cè)定

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.3.3 游離脂肪酸的測(cè)定

1.3.3.1 脂肪的提取

參照FOLCH等[17]的方法提取脂質(zhì)，取發(fā)酵香腸1.0 g，加入氯仿-甲醇(2∶1，V∶V)20 mL后低速勻漿，靜置1 h，過(guò)濾后加入0.2倍體積的生理鹽水(7.3 g/L NaCl，0.5 g/L CaCl2)，3 600 r/min離心15 min，吸凈上層液體，剩余液體用氮吹儀吹干溶劑。

1.3.3.2 脂肪酸的甲酯化

稱取揮干溶劑后的脂質(zhì)0.15 g，加入2 mL 14%三氯化硼-甲醇進(jìn)行甲酯化(60 ℃水浴30 min)，冷卻后加入2 mL水和2 mL正己烷振蕩混勻，靜置分層后吸取上層液體，揮干溶劑，加入100 μg/mL十七酸甲酯做內(nèi)標(biāo)，用正己烷定容，以備氣相測(cè)定。

1.3.3.3 氣相條件

色譜柱：SP2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm)；檢測(cè)器溫度：260 ℃；升溫程序：120 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至230 ℃，保持3min，以1.5 ℃/min升至240 ℃，保持13 min；氣體流速：H245.0 mL/min，空氣450.0 mL/min，氮?dú)?.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL；分流比1∶10。

1.3.3.4 定性定量分析

根據(jù)37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)來(lái)確定各脂肪酸的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析；以十七酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±SD，圖表采用Excel進(jìn)行繪制，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS Statistics 18 統(tǒng)計(jì)分析軟件中的比較均值中的獨(dú)立樣品T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸價(jià)(AV)

AV表示脂肪中游離脂肪酸含量，可作為衡量脂肪分解程度的指標(biāo)[18]。圖1所示，AV總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明發(fā)酵香腸的脂肪不斷分解為脂肪酸，且脂肪酸的生成速度大于分解速度，與許美娜等的研究成果一致[19]。

圖1 各組發(fā)酵香腸AV隨加工貯藏時(shí)間的變化Fig.1 Changes of AV of fermented sausages in each group with processing and storage time

發(fā)酵香腸在3～18 d，自然組、漢森組、復(fù)配組AV分別提高了1.95、2.92和4.03 mg/g，復(fù)配組提高最多。在18、41、71d，復(fù)配組和漢森組AV顯著高于(P<0.05)自然組。由此可以證明，復(fù)配發(fā)酵劑有利于發(fā)酵香腸脂肪的分解。

2.2 過(guò)氧化值(POV)

POV表示脂質(zhì)氧化初級(jí)產(chǎn)物過(guò)氧化物的積累量[20]。由圖2可知，各發(fā)酵組POV均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，各發(fā)酵組變化顯著(P<0.05)，與李鈺[21]、SOHN等[22]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可能因?yàn)檫^(guò)氧化物不穩(wěn)定可繼續(xù)氧化分解為其他物質(zhì)。在11～18 d，復(fù)配組的POV增長(zhǎng)率為156%，高于其他2組。在41d，復(fù)配組POV顯著高于(P<0.05)其他2組。在71 d，各組香腸的POV達(dá)到最大值，自然組、漢森組、復(fù)配組分別為2.54 mmol/kg、2.96 mmol/kg和3.31 mmol/kg，復(fù)配組最高，但差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明復(fù)配發(fā)酵劑的添加，對(duì)脂肪氧化初級(jí)產(chǎn)物的產(chǎn)生有一定的作用。

圖2 各組發(fā)酵香腸POV隨加工貯藏時(shí)間的變化Fig.2 Changes of POV of fermented sausages in each group with processing and storage time

2.3 硫代巴比妥酸值(TBARS)

TBARS值表示組織中丙二醛的累積量。丙二醛是由不飽和脂肪酸分解所產(chǎn)生的[23]，代表著脂質(zhì)二級(jí)氧化產(chǎn)物。由圖3可知，各發(fā)酵組的TBARS值先顯著上升(P<0.05)后下降，可能因?yàn)橘A藏前期不飽和脂肪酸分解較快，醛類物質(zhì)積累，貯藏后期醛類與肉中的蛋白質(zhì)、氨基酸或其他含有氨基側(cè)鏈基團(tuán)的物質(zhì)發(fā)生羰氨反應(yīng)[24]。在3～11 d，TBARS持續(xù)増加，說(shuō)明脂肪酸在低溫條件下也可以發(fā)生氧化[25]。在41 d，復(fù)配組TBARS達(dá)到最大值0.35 mg/kg。在41～161 d，漢森組和復(fù)配組的TBARS顯著高于(P<0.05)自然組，繼而證明復(fù)配發(fā)酵劑可提高發(fā)酵香腸脂肪氧化能力。

圖3 各組發(fā)酵香腸TBARS隨發(fā)酵香腸加工貯藏時(shí)間的變化Fig.3 Changes of TBARS of fermented sausages in each group with processing and storage time

2.4 游離脂肪酸的變化

脂質(zhì)在脂肪酶和磷脂酶的作用下被分解為甘油酯和磷脂釋放游離脂肪酸，釋放的游離脂肪酸直接影響發(fā)酵香腸的風(fēng)味[26]。由表1可知，共檢測(cè)出15種脂肪酸，主要脂肪酸是C16∶0、C18∶0和C18∶1n9c，與王柏輝[27]、CHEN等[28]研究一致。

表1 各組發(fā)酵香腸游離脂肪酸隨加工貯藏時(shí)間的變化 單位：mg/g(脂肪)

續(xù)表1

結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式分組3 d11 d18 d25 d41 d71 d161 d自然組0.1650.3180.3550.3070.3090.2760.298C17∶1漢森組0.2650.2800.2890.3020.3070.3300.292復(fù)配組0.1450.2960.2560.3410.4470.3180.225自然組3.3404.3095.1826.2035.7505.4705.434C18∶0漢森組3.7805.3345.2825.1456.0156.3245.453復(fù)配組2.8776.3795.2865.6867.0105.7964.045自然組0.4280.7261.2280.8420.7610.7261.066C18∶1n9t漢森組0.4571.0350.9041.1540.8780.8160.827復(fù)配組0.3541.3350.7321.4071.6271.1370.650自然組7.42312.67315.11215.30713.61715.26412.846C18∶1n9c漢森組9.28513.07812.64414.18413.71718.08517.079復(fù)配組6.35515.97410.85415.47121.36316.32613.702自然組-0.1040.1490.1500.1360.1160.129C18∶2n6t漢森組0.0670.1360.1460.1470.0880.1300.123復(fù)配組-0.1590.1050.1080.1970.138-自然組0.6241.4021.2061.2401.7371.3510.886C18∶2n6c漢森組1.2251.0431.2341.2291.4131.3421.121復(fù)配組0.6241.4021.2061.2291.7371.3510.886自然組0.2860.3870.5250.5780.6700.5350.558C18∶3n3漢森組0.3830.4530.6130.5560.6930.6310.524復(fù)配組0.2770.5030.4460.6250.8370.5960.510自然組0.0740.1270.1820.1910.1770.1620.175C21∶0漢森組0.0830.1600.2100.1900.1930.1990.179復(fù)配組0.0620.2140.1370.2460.2990.1870.138自然組-0.0460.0510.0550.080-0.054C22∶0漢森組0.056-0.0470.0490.058--復(fù)配組-0.0490.0460.0570.1000.058-

注：-為未檢測(cè)出。

各組香腸中的C16∶0、C18∶0和C18∶1n9c，呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，與黃金枝等[29]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，后期下降可能是因?yàn)樗种饾u降低，酶活力減弱，脂肪分解能力下降。在3～11 d，各脂肪酸的生成量明顯增加，且復(fù)配組增長(zhǎng)最快。在11、25、41 d，復(fù)配組的C16∶0含量明顯高于其他2組。在11、18、41 d，復(fù)配組的C18∶0含量明顯高于其他2組。C18∶1n9c是發(fā)酵香腸中含量最高的脂肪酸，是重要的風(fēng)味前體物質(zhì)[20]。在41 d，復(fù)配組的C18∶1n9c含量達(dá)到最大值21.363 mg/g，明顯高于其他兩組。可以看出，復(fù)配發(fā)酵劑的使用有利于游離脂肪酸的產(chǎn)生，對(duì)發(fā)酵香腸風(fēng)味的改善有促進(jìn)作用。

2.5 飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的變化

脂肪酸一般可分為SFA、MUFA、PUFA三類。SFA主要為人體提供能量，可增加人體膽固醇和中性脂肪。不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)是人體不能合成必須從膳食中獲取的脂肪酸，有調(diào)節(jié)血脂、清理血栓、提高人體的免疫力等功能，對(duì)人體有重要的意義[30]。

由表1可知，共檢測(cè)出7種飽和脂肪酸，其中C16∶0，C18∶0的含量相對(duì)較高，其余SFA含量在1 mg/g以下。各組SFA在加工及貯藏時(shí)間均呈先增長(zhǎng)后下降趨勢(shì)。在3～11 d，各組香腸的SFA含量增長(zhǎng)較大，自然組、漢森組和復(fù)配組分別增長(zhǎng)了3.67 mg/g、3.005 mg/g和13.142 mg/g，其中復(fù)配組增長(zhǎng)幅度最大，可能是添加具有脂肪分解作用的木糖葡萄球菌加速了脂肪酸的產(chǎn)生。在貯藏后期，各組SFA逐漸下降，在161 d，復(fù)配組SFA含量為11.25 mg/g，明顯低于其他2組。

由表1可示，共檢測(cè)出5種單不飽和脂肪酸，其中C18∶1n9c的含量相對(duì)較高，在41 d，復(fù)配組的C18∶1n9c的含量達(dá)到最大值21.363 mg/g。由表2可知，在3～11 d，各組香腸的MUFA含量驟增，這可能是PUFA轉(zhuǎn)化為MUFA的速率大于MUFA轉(zhuǎn)化為SFA的速率[31]，且復(fù)配組最為明顯，增長(zhǎng)了11.451 mg/g。在11、18、41d，復(fù)配組的MUFA明顯高于其他2組。在41 d以后，MUFA處于下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)槠溲趸俣却笥诋a(chǎn)生速度。可以說(shuō)明，在貯藏初期，復(fù)配組的MUFA相對(duì)較高。

表2 各組發(fā)酵香腸SFA、MUFA、PUFA隨加工貯藏時(shí)間的變化 單位：mg/g(脂肪)

由表1所示，共檢測(cè)出3種PUFA，分別為C18∶2n6t，C18∶2n6c和C18∶3n3，其中C18∶3n3是人體必需脂肪酸，是維持生命的重要物質(zhì)，能在體內(nèi)經(jīng)脫氫和碳鏈延長(zhǎng)合成C20∶5、C22∶6等代謝產(chǎn)物[31]，C20∶5、C22∶6對(duì)腦功能、智力和視力發(fā)育有重要意義，在41 d，復(fù)配組的C18∶3n3含量明顯大于其他2組。PUFA最易被氧化[32-33]，所以含量明顯少于SFA和MUFA。各組PUFA的均呈先上升后下降趨勢(shì)，在3～11 d，各組PUFA增長(zhǎng)較快。復(fù)配組在41d達(dá)到最大值2.771 mg/g，高于其他2組，隨后不斷下降，說(shuō)明貯藏時(shí)間越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的PUFA越多。

2.6 脂肪酸比例的變化

隨著對(duì)脂肪營(yíng)養(yǎng)的深入研究,脂肪酸的營(yíng)養(yǎng)及預(yù)防疾病的作用、攝入量等日益受到關(guān)注。n-6 PUFA/n-3 PUFA是一個(gè)評(píng)價(jià)肉制品品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)研究表明，過(guò)高的n-6 PUFA和n-6 PUFA/n-3 PUFA可促進(jìn)多種疾病的爆發(fā)，如心血管疾病、癌癥和炎癥和自身免疫性疾病。n-6 PUFA/n-3 PUFA的值應(yīng)控制在4以下為宜[34]。

表3 各組發(fā)酵香腸n-6PUFA/n-3PUFA隨加工貯藏時(shí)間的變化Table 3 Changes of n-6PUFA/n-3PUFA of fermentedsausage in each group with processing and storage time

由表3可知，各組發(fā)酵香腸各個(gè)時(shí)間段的n-6PUFA/n-3PUFA值皆在4.0以下，只是自然組在11 d時(shí)接近4。在25～161 d，復(fù)配組的n-6PUFA/n-3PUFA的值略低于自然組。

PUFA/SFA是評(píng)價(jià)肉制品營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，減少SFA的含量，增加PUFA的含量更有利于人的身體健康[35]。由表4所示，復(fù)配組和漢森組PUFA/SFA的變化趨勢(shì)一致，自然組變化波動(dòng)較大。在18～161 d，漢森組和復(fù)配組PUFA/SFA的比值變化不明顯，相比于自然組更穩(wěn)定。

表4 各組發(fā)酵香腸PUFA/SFA隨加工及貯藏時(shí)間的變化Table 4 Changes of PUFA/SFA of fermented sausage ineach group with processing and storage time

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，在18、41、71 d，復(fù)配組和漢森組的AV顯著高于(P<0.05)自然組；復(fù)配組的POV高于其他2組，但差異不顯著(P>0.05)；在41～161 d，復(fù)配發(fā)酵組和漢森發(fā)酵組的TBARS顯著高于(P<0.05)自然組；在11和41 d，復(fù)配組主要脂肪酸C16:0、C18:0和C18:1n9c含量皆高于其他2組,在18～161 d，n-6PUFA/n-3PUFA值略低于自然組，PUFA/SFA的值相對(duì)穩(wěn)定。研究證明，復(fù)配發(fā)酵劑的使用加速了香腸的脂肪氧化程度，并未出現(xiàn)不良現(xiàn)象，各指標(biāo)都在安全范圍之內(nèi)，對(duì)改善發(fā)酵肉制品風(fēng)味有重要意義，其脂肪酸比例更有益于人體健康。