基于生化成分構建不同地區黑茶分類模型

常睿，馬夢君，羅理勇,3，余霞，代麗鳳，曾亮,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(咸寧市農業科學院，湖北 咸寧，437000) 3(西南大學 茶葉研究所，重慶，400715)

黑茶，因成品茶外觀呈黑色而得名，是我國六大茶類之一，生產歷史悠久，生產區域廣闊，花色品種眾多，其代表品種有湖北青磚茶、湖南茯磚茶、四川康磚茶、云南普洱(熟)茶和廣西六堡茶等[1]。黑茶滋味醇和，具有生津止渴、減肥降脂[2]、健胃助消[3]、抗氧化[3]、抗癌[4]、降血糖[5]等多種功效，備受消費者喜愛。然而，不同地區、不同品類黑茶質量參差不齊，直接影響黑茶的消費和售價；隨著黑茶產業呈良好發展態勢，市場上虛假標榜黑茶產地、以次充好的現象屢見不鮮[6]，這嚴重影響黑茶產業健康發展和消費者基本權益；因此，開展黑茶產地鑒別研究顯得極其重要。

傳統茶葉鑒別方法主要為感官評定或簡單理化指標檢測，前者主觀性強，后者步驟繁瑣，無法全面反映茶葉的整體特征[7]。因此，利用現代分析儀器獲取樣品組分信息，再結合多元統計方法進行數據分析以最大程度獲取有效信息，在樣品成分信息差異、地域特征和品質特性之間建立關聯，進而篩選特征性物質和構建模型，已成為茶葉產地與種類鑒別的重要模式。NING等[8]以六大茶類436個樣本為研究對象，采用高效液相色譜測定其兒茶素、咖啡因、茶氨酸含量，并結合Fisher逐步判別分析構建模型，結果表明，該模型能夠有效鑒別六大茶類。王淑慧等[9]采用HPLC指紋圖譜技術對3種名優綠茶31個樣品的茶湯特征滋味成分進行檢測分析，并利用逐步判別分析法對不同綠茶種類進行判別，其判別正確率為100%。戴悅雯等[10]對4個不同等級的西湖龍井茶分別進行香氣屬性感官審評和電子鼻檢測，通過Fisher判別分析法和K-最近鄰算法進行特征提取和模式分類，實現對訓練集樣本100%和測試集樣本97.5%的正確識別。Fisher判別分析法是依據方差分析原理建立而成，在區分少數樣本時具有直觀、快速簡便的優勢，且對總體的分布和方差無特殊要求，因而在產地鑒別領域具有廣泛應用[7-10]。但目前茶葉鑒別研究主要集中在六大茶類和部分名優綠茶上[7-10]，尚未見運用Fisher判別法識別黑茶產地的研究報道。

鑒于此，本研究以湖南、湖北、四川、云南4個地區具代表性的55個黑茶樣本為研究對象，采用HPLC等方法檢測其主要生化成分，并通過主成分分析(principal component analysis，PCA)和系統聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)篩選特征性成分和研究產地聚類，同時通過Fisher判別分析篩選引起不同地區黑茶產生差異的主要化合物，建立黑茶分類的判別函數模型，以期為黑茶的品質評定和地區判別提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黑茶采集于湖南、湖北、四川、云南等地，共計55個樣本，均為緊壓茶。因六堡茶品質獨特，與其他黑茶差異明顯，如具有松煙香、檳榔香等[11]，故本研究未選擇六堡茶作為樣品。根據相關標準[12-13]，青磚茶、茯磚茶和普洱茶(熟茶)緊壓茶不分等級，康磚茶分為特制和普通2個等級。研究報道，在一定的貯藏時間內，黑茶品質相對穩定，因此樣本的生產年份集中于2015～2017年[14]。同一公司樣品采集前均貯藏于該公司具恒溫恒濕條件的倉庫，采集后均貯藏于實驗室4 ℃冰箱，保證了貯藏環境的一致性。樣品具體信息見表1。

表1 不同地區黑茶樣品編號Table 1 The numbers of dark teas in different areas

運用Fisher判別分析法建模時，隨機選擇4個地區各3個樣品作為預測樣本集用于驗證模型，剩余樣品則作為建模樣本集用于建立模型。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

福林酚、甲醇(色譜純)、冰乙酸(色譜純)、Na2CO3、AlCl3、水合茚三酮、氯化亞錫、Na2HPO4、KH2PO4、H3PO4、蒽酮、H2SO4、正丁醇、95%乙醇、乙酸乙酯、NaHCO3、草酸、沒食子酸、谷氨酸、葡萄糖，均購自重慶永捷實驗儀器有限公司；咖啡堿、兒茶素(catechin，C)、表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、草酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸均為標準品，購自美國Sigma公司。

1.2.2 儀器與設備

LC-20高效液相色譜儀，日本島津公司；Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，美國安捷倫科技有限公司；FA1004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；722-型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；5810臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；KQ5200DE超聲波振動儀，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；微孔濾膜(0.45 μm)，上海市新亞凈化器件廠；高速中藥粉碎機，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶多酚、黃酮、游離氨基酸總量、可溶性總糖、茶色素類的檢測

茶多酚(福林酚法，參照GB/T 8313—2008)；黃酮(AlCl3比色法，參照《茶學實驗技術》[15])；游離氨基酸總量(茚三酮比色法，參照GB/T 8314—2013，根據MAGNé等的研究方法略有改進[16])；可溶性總糖(蒽酮比色法，參照《茶學實驗技術》[15]，根據BUYSSE等的研究方法略有改進[17])；茶色素類(分光光度法，參照《茶學實驗技術》[15])。

1.3.2 兒茶素組分和咖啡堿的檢測[18]

流動相A：2‰冰乙酸，流動相B：100%純甲醇；色譜柱：Hypersil BDS C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；進樣量：10 μL；流速：0.9 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：278 nm；檢測時間：37 min，采用梯度洗脫程序。

1.3.3 有機酸組分的檢測[19]

流動相A：0.05 mol/L KH2PO4溶液(用H3PO4調pH 2.7)，流動相B：100%純甲醇，V(流動相A)∶V(流動相B)=97∶3；色譜柱：同1.3.2；進樣量：20 μL；流速：0.6 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；檢測時間：30 min。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 單因素方差分析與多重比較

文獻報道，不同地區黑茶由于原料基礎和加工工藝的不同，其品質風味、生化成分的含量與組成特征存在較大差別[20]。為明確不同地區黑茶生化成分的含量差異，本研究選擇對黑茶品質風味和功能影響較大的19類生化成分進行比較和分析[20-27]。

2.1.1 不同地區黑茶的主要生化成分含量

由圖1可知，云南熟普的茶多酚平均含量顯著高于其他地區，湖南茯磚次之，湖北青磚和四川康磚最低，且無顯著差異；云南熟普的總黃酮平均含量顯著高于其他地區，湖南茯磚和四川康磚次之，湖北青磚顯著低于其他地區；除湖北青磚外，各地區黑茶可溶性總糖平均含量無顯著差異；云南熟普的游離氨基酸和咖啡堿平均含量均顯著高于其他地區，且其他3個地區無顯著差異。

圖1 不同地區黑茶主要生化成分的平均含量Fig.1 The average content of biochemical components in dark teas for different areas注：各生化成分不同地區黑茶之間，不同小寫字母，表示差異顯著(P<0.05)，誤差條高度數值為±標準差，在本研究中反映的是同一地區黑茶在某生化成分數據中的離散程度，其高度越低代表這類黑茶的品質越穩定，圖2 ～圖4同。

茶多酚具有抗氧化、抗衰老、防癌抗癌、防治心血管疾病等多種生理功能，且對茶湯苦澀濃強滋味有重要貢獻[21]；黃酮類化合物由于母核常含羥基、甲氧基和烴氧基等助色團而多顯黃色，同時具有抗氧化、抗突變等功效[21]；游離氨基酸既是茶湯鮮爽滋味的重要成分，又可與糖類發生羰氨反應生成揮發性物質，還可在特殊溫濕條件下發生氧化、降解和轉化，與多酚類反應生成褐色色素影響茶湯色澤[20]；咖啡堿是茶湯苦味的重要物質基礎，且具有興奮神經中樞和利尿等藥理功能，其與茶黃素、蛋白質等以氫鍵締合后形成的復合物具有鮮爽味[21]；云南熟普的茶多酚、總黃酮、游離氨基酸和咖啡堿的平均含量均顯著高于其他地區黑茶，這可能是云南熟普內質湯色紅濃明亮、滋味濃厚回甘，且具有多種生理功能的重要原因。有研究認為，云南普洱茶獨特的品質特征可能是其特殊原料和環境所致[22-23]：云南地處中國西南部，由于受地形地貌和印度洋、太平洋季風影響，氣候類型多樣，擁有雨量豐沛、光照充足、年溫差小、日溫差大等得天獨厚的自然條件，因此曬青毛茶含有比一般原料更豐富的化學成分[23]，這些成分可為渥堆或自然陳化過程中的生物轉化提供有利的物質基礎。齊桂年等[24]認為，康磚和茯磚的茶多酚含量產生差異的主要原因是原料嫩度不同，湖南茯磚的原料主要是以湖南黑毛茶三級為主；而四川南路邊茶主要是以修剪枝葉的毛莊茶、做莊茶為主，更加粗老。

2.1.2 茶色素組分

由圖2可知,各地區黑茶的茶色素組分中，茶褐素含量最高，其次是茶黃素，含量最低的是茶紅素。云南熟普的茶黃素平均含量顯著高于其他地區，湖北青磚次之，湖南茯磚和四川康磚最低，且無顯著差異；湖北青磚和湖南茯磚的茶紅素平均含量顯著高于其他2個地區；云南熟普的茶褐素平均含量顯著高于其他地區，湖北青磚和四川康磚次之，湖南茯磚顯著低于其他地區。茶色素(主要包括茶黃素、茶紅素和茶褐素)是茶多酚的主要水溶性氧化產物，不僅是組成茶湯黃、橙、棕的主體，也參與干茶色澤的形成[25]；茶黃素和茶紅素是茶多酚氧化聚合過程中的中間產物，在黑茶中積累較少，而茶褐素作為最終氧化聚合產物，在黑茶中積累最多；云南熟普的茶黃素和茶褐素平均含量均顯著高于其他地區黑茶，這可能是形成其外形色澤紅褐、湯色紅濃明亮、葉底紅褐等獨特品質特征的重要原因[26]。

圖2 不同地區黑茶茶色素組分的平均含量Fig.2 The average content of tea pigment components in dark teas in different areas

2.1.3 兒茶素組分

兒茶素是茶多酚的主體成分，其單體主要包括6種：C、EC、EGC屬于非酯型兒茶素，ECG、GCG、EGCG屬于酯型兒茶素[25]。由圖3可知，各地區黑茶的兒茶素組分中，除EGCG較高之外，其他5種兒茶素的平均含量較低。云南熟普的兒茶素組分以簡單兒茶素為主，而其他地區的兒茶素組分以酯型兒茶素為主，且EGCG含量最高。四川康磚的C平均含量顯著高于其他地區；湖北青磚的EC平均含量顯著高于其他地區；湖南茯磚的EGC平均含量顯著高于其他地區；各地區黑茶的ECG平均含量差異顯著，由高到低為四川康磚>湖南茯磚>湖北青磚>云南熟普；四川康磚的GCG平均含量顯著高于其他地區；各地區黑茶的EGCG平均含量差異顯著，由高到低為四川康磚>湖南茯磚>湖北青磚>云南熟普。

圖3 不同地區黑茶兒茶素組分的平均含量Fig.3 The average content of catechin components in dark teas in different areas

2.1.4 有機酸組分

黑茶中的有機酸含量與發酵程度呈高度正相關，嚴重制約渥堆發酵的微生物菌群，對酸堿平衡起重要的調節作用，同時有機酸作為糖類分解的中間產物，對香氣形成也具有重要作用，但目前研究相對較少[27]。

圖4 不同地區黑茶有機酸組分的平均含量Fig.4 The average content of organic acid components in dark teas in different areas

由圖4可知，各地區黑茶的有機酸組分中，草酸和蘋果酸含量最高，其次是奎尼酸，含量最低的是檸檬酸和琥珀酸。云南熟普的草酸平均含量顯著高于其他地區；湖南茯磚的奎尼酸平均含量顯著高于其他地區；除云南熟普外，各地區黑茶的蘋果酸平均含量無顯著差異；各地區黑茶的檸檬酸平均含量無顯著差異；四川康磚的琥珀酸平均含量顯著高于其他地區。

鑒于單因素方差分析只能對4個地區黑茶生化成分的平均含量差異進行評估，無法對各生化成分在不同地區黑茶樣品的分布規律及特征進行比較分析，且單一分析方法對數據的內部關系及整體評價存在局限性[28]，為此，本研究綜合運用單因素方差分析、主成分分析、系統聚類分析、Fisher判別分析4種分析方法進行多變量分析處理。

2.2 主成分和聚類分析

2.2.1 主成分分析

PCA分析是將上述55個黑茶樣品檢測所得19種生化成分進行數據轉換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分類，從而在分析圖上只顯示最重要的2個綜合指標，形成二維樣品得分散點圖(圖5-A)和旋轉載荷矩陣圖(圖5-B)。由表2結合旋轉載荷矩陣表可知，PC1～PC8分別可解釋全部成分變量信息的33.95%、17.51%、10.80%、8.53%、5.18%、4.23%、3.60%、3.25%，累積貢獻率達87.06%；其中茶褐素、游離氨基酸總量、咖啡堿、黃酮、茶多酚對第1主成分貢獻率較大，GCG對第2主成分貢獻率較大，EGC對第3主成分貢獻率較大，檸檬酸對第4主成分貢獻率較大(表2)。

表2 主成分的特征值和方差貢獻率Table 2 Eigenvalue and variance contribution rates ofprincipal components

由圖5-A可知，不同地區黑茶在第1、2主成分的得分圖上有一定程度的聚類趨勢，其中四川康磚主要分布于第1象限，分布較集中，與湖南茯磚有一定交叉；湖北青磚和湖南茯磚主要分布于第3象限，這2類茶呈交叉分布；云南熟普主要分布于第2和第4象限，且與其他黑茶距離較遠。結合圖5-B可知，第1象限主要為以GCG、C、ECG、EGCG含量較高，而茶黃素含量較低的四川康磚為代表的黑茶；第3象限主要為以EC、茶紅素含量較高，而茶褐素、黃酮含量較低的湖北青磚和湖南茯磚為代表的黑茶；第2、第4象限主要為以茶褐素、游離氨基酸總量、茶多酚、咖啡堿、黃酮、草酸、茶黃素含量較高，而EGCG、ECG含量較低的云南熟普為代表的黑茶；此結果與單因素方差分析結果一致。

A-主成分得分散點圖; B-旋轉載荷矩陣圖圖5 主成分得分散點圖和旋轉載荷矩陣圖Fig.5 Scatter plot of PCA scores and rotation load matrix diagram

2.2.2 系統聚類分析

以歐氏距離的平方為不同類別數據點間距離(相似度)的計算準則，以組間平均連接法為組群的合并準則，對4個地區共55個黑茶樣品進行HCA，結果見圖6。選取不同的歐式距離可獲得不同的分類結果：在15歐氏距離處，55個黑茶樣品聚為2類，第1類為YN42～YN55，這類黑茶均為云南熟普，與其他地區黑茶的品質有明顯區別，其茶多酚、總黃酮、游離氨基酸、咖啡堿、茶黃素、茶褐素、草酸含量較高；湖北青磚、湖南茯磚和四川康磚聚為第2類；此分類與PCA結果一致。在5歐氏距離處，第2類可分為2個亞類，其中第1亞類為HB4、HB5、HB6，這類黑茶均為湖北青磚。在2歐氏距離處，第2亞類可分為11個小類，HN23、SC33、SC35、SC36、SC38、SC39聚為第1小類；SC29、SC41聚為第2小類；HN16、HN21聚為第3小類；HN15、HN25、HN27聚為第4小類；HB2、HB3、HB8、HB9、HB12、HB14聚為第5小類；HB1、HB7、HB10、HB13、HN22、SC32聚為第6小類；SC31、SC34、SC37、SC40聚為第7小類；HB11和SC30分別為第8小類與第9小類；HN17、HN18、HN19、HN20、HN24聚為第10小類；HN26和SC28聚為第11小類；其中有8個小類都以某一地區的黑茶樣品為主，這說明同一地區同一類別黑茶易聚在一起，其品質具有一定的相似性和共性，側面反映了本研究所選樣品的典型性。

圖6 不同地區黑茶的聚類分析樹狀圖Fig.6 Cluster analysis dendrogram of dark tea in different areas

PCA和HCA結果均表明，云南熟普很好地聚為一類，但其他地區黑茶不能被有效識別。這可能是由于特征值大于1的主成分有前4個，但累積貢獻率不足85%，這使得PCA在本研究中的應用存在信息量提取不足、特征向量方向不確定等缺點[29]；HCA作為一種無管理模式的識別方法，所得結果很大程度上取決于方法所采用的距離、類間距等參數，不一定能反映數據的真實模型[30]；因此提出一種有監督的數據降維方法在黑茶分類中變得尤為關鍵。

2.3 Fisher判別分析

Fisher判別分析是一種把高維數據壓縮為一維數據的多元分析方法，基本思路就是從N個總體中抽取具有P個指標的樣品觀測數據，通過方差分析構造一維判別函數或判別式，然后應用該線性函數把P維空間中的已知類別總體以及求知類別歸屬的樣本都變換為一維數據，再根據其間的親疏程度把未知歸屬的樣本點判定其歸屬；與其他方法不同之處在于，判別分析是一種有指導有監督的分類預測方法[30](表3)。

表3 黑茶類型典型判別結果Table 3 Results obtained for dark tea classification by stepwise canonical discrimination analysis

Fisher判別分析結果表明，共有7個變量對判別效果影響極顯著。其影響大小依次為：茶褐素>ECG>EGC>黃酮>C>EGCG>EC(根據F值大小)，其他生化成分對此判別模型的影響不顯著(P>0.05)。通過判別分析，建立了3個典型判別式函數(Y)，分別為：

Y1=-3.926+0.423×ρ(黃酮)+0.064×ρ(茶褐素)+0.178×ρ(C)-0.073×ρ(EC)+0.135×ρ(EGC)-0.273×ρ(ECG)-0.182×ρ(EGCG)

(1)

Y2=-6.623+0.431×ρ(黃酮)+0.010×ρ(茶褐素)+1.308×ρ(C)-0.298×ρ(EC)-0.031×ρ(EGC)+0.592×ρ(ECG)+0.034×ρ(EGCG)

(2)

Y3=-0.395-0.231×ρ(黃酮)+0.039×ρ(茶褐素)+1.559×ρ(C)+0.172×ρ(EC)-0.646×ρ(EGC)-0.006×ρ(ECG)+0.051×ρ(EGCG)

(3)

其中前2個典型判別式函數分別可解釋71.6%和19.4%的方差變化，Y3解釋了9.0%的方差變化。通過以上2個判別函數，分別計算不同地區黑茶樣品在前2個函數的得分，以Y1為橫坐標，Y2為縱坐標，得到不同地區黑茶的線性判別圖(圖7)。由表3可知，在原始分類結果中4個地區黑茶被完全分開；在交叉驗證分類結果中，湖北青磚正確率為100.0%，湖南茯磚正確率為100.0%，四川康磚正確率為90.9%，云南熟普正確率為100.0%，9.1%的四川康磚被預測到湖南茯磚中；整體原始分類正確率(即回判成功率)為100%，交叉驗證正確分類率為97.7%；在未分組案例中，僅有1個湖南茯磚被誤判到四川康磚，外部驗證正確分類率為91.7%。圖7顯示線性判別得分，湖北青磚、湖南茯磚、四川康磚的分組界限不清晰，但4個地區黑茶樣品在空間上能夠良好地區分，表明選擇的7種生化成分可以反映不同地區黑茶生化成分特征的差異與聯系，用得到的判別函數可以實現不同地區黑茶的良好區分。

圖7 不同地區黑茶的線性判別得分圖Fig.7 Scatter plot of fisher linear discriminant scores of dark tea in different areas

3 結論

不同地區黑茶因產地、原料和制作工藝不同，其品質也具有獨特性。本研究以4個地區55個黑茶為研究對象，通過HPLC等技術檢測其生化成分，并結合多元統計分析方法研究后得出：

(1)單因素方差分析結果表明，云南熟普的茶多酚、總黃酮、游離氨基酸、咖啡堿、茶黃素、茶褐素、草酸含量顯著高于其他地區，但ECG、EGCG含量顯著低于其余地區；云南熟普的兒茶素組分以簡單兒茶素為主，而湖北青磚、湖南茯磚、四川康磚的兒茶素組分均以酯型兒茶素為主，且EGCG含量最高。

(2)PCA結果表明，不同地區黑茶生化成分的含量與組成特征差異較大，四川康磚以GCG、C、ECG、EGCG含量較高，而茶黃素含量較低為特征；湖北青磚和湖南茯磚的生化成分組成特征接近，主要以EC、茶紅素含量較高，而茶褐素、黃酮含量較低為特征；云南熟普主要以茶褐素、游離氨基酸總量、茶多酚、咖啡堿、黃酮、草酸、茶黃素含量較高，而EGCG、ECG含量較低為特征。HCA結果表明，云南熟普易聚為一類，與其他地區黑茶品質差異明顯，但其他地區黑茶不能被有效區分；同一地區黑茶較易聚在一起，其品質具有一定的相似性和共性。

(3)Fisher判別分析結果表明，雖然分組界限不清晰，但4個地區黑茶樣品在空間上能夠被良好區分；茶褐素、ECG、EGC、黃酮、C、EGCG和EC是影響判別分析結果的主要物質，并根據這7種化合物建立了區分4個地區黑茶的判別函數，其原始分類正確率(即回判成功率)為100%，交叉驗證正確分類率為97.7%，外部驗證正確分類率為91.7%。

鑒于黑茶獨有的微生物代謝參與使其品質形成極為復雜、不同地區黑茶的生化成分種類及含量差異較大，本研究僅選取4個地區最具代表性的黑茶且樣本數量有限，因此研究所得分類模型和函數不一定適用所有黑茶產地鑒別，但這種基于生化成分、結合多元統計方法來構建分類模型的方法可為更多黑茶的區分提供參考價值，并可為規范黑茶加工方式及保證黑茶品質安全、質量標準提供一定的理論依據。