根瘤菌胞外多糖的分離純化及組分分析

王路瑤，湯斌

(安徽工程大學(xué) 生化學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

多糖是由多個相同或不同的單糖之間脫水形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分支連接而成的一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子聚合物[1]，作為細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成成分而廣泛存在于植物、動物、微生物(包括細(xì)菌、真菌)及藻類等生命體中。與真菌或植物中提取的細(xì)胞壁多糖相比，細(xì)菌分泌到周圍環(huán)境中的胞外多糖(exopoly saccharides, EPS)主要是由規(guī)則的重復(fù)單元構(gòu)成的均質(zhì)多糖[2]，分子質(zhì)量一般較大，其重復(fù)單位通常在1 000個以上。由于微生物多糖具有獨特的理化性質(zhì)和生物性質(zhì)，越來越多的微生物多糖在各行業(yè)都得到了廣泛的應(yīng)用。例如，由假黃單胞菌屬產(chǎn)生的黃原膠可作為乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑和凝膠增稠劑等運用于工業(yè)生產(chǎn)的各個領(lǐng)域[3]；由芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生的普魯蘭多糖，是一種胞外水溶性黏質(zhì)多糖，可作為食品品質(zhì)的被膜劑、改良劑和增稠劑等[4]，又因其在自然界可被微生物降解利用，不會引起環(huán)境污染，還被譽為無公害塑料[5]。2006年我國批準(zhǔn)了由微生物產(chǎn)生的可得然膠作為食品添加劑，它可以改善食品的黏彈性、穩(wěn)定性和持水性等[6-7]。此外，微生物多糖還可作為生物吸附劑和乳化劑[8-9]，具有生態(tài)環(huán)境修復(fù)的潛力。

研究表明，根瘤菌胞外多糖不僅能夠增強機體免疫力[10-11]，還具有抗氧化和抗腫瘤[10,12-14]等活性。2017年URAI等[15]研究了根瘤菌M2產(chǎn)生的胞外多糖，發(fā)現(xiàn)其具有先天免疫刺激活性。雖然上述文獻從不同角度對根瘤菌胞外多糖的功能與活性關(guān)系進行了研究，但大多數(shù)研究中使用的胞外多糖均是混合多糖，而沒有對單組分多糖結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系進行研究。此外，不同微生物細(xì)胞，即使是來源同一種的不同株之間，其個體之間代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)也可能具有巨大差異，尤其是一些次級代謝產(chǎn)物和大分子物質(zhì)，例如維生素、色素、蛋白質(zhì)和多糖等。因此，分離并分析根瘤菌胞外多糖組分，可為該種屬微生物的胞外多糖組成和活性功能研究提供重要的理論參考。為此，本文對研究中所分離得到的1株根瘤菌的胞外多糖進行了單組分分離、純化和糖組分分析等工作，為進一步深入地研究各組分的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本研究中所使用的根瘤菌(Rhizobiumsp. TY-03)由本實驗室篩選、鑒定并保藏。

1.1.2 試劑

無水乙醇、蒽酮、H2SO4、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、考馬斯亮藍(lán)G 250、NaCl等,國藥集團化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白和木瓜蛋白酶(≥2 000 units/mg),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Sephadex G-200葡聚糖凝膠和DEAE-52纖維素,北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加水煮沸20～30 min，8層紗布過濾，濾液中加入20 g葡萄糖，定容至1 L，115 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯浸出汁酶解液：稱取去皮馬鈴薯300 g切成小塊，加蒸餾水煮沸20～30 min，8層紗布過濾棄渣，向濾液加入0.2 g淀粉酶，65 ℃恒溫水浴至水解液遇碘液無色為止，定容至1 L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35 g、酵母粉25 g、K2HPO40.8 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.10 g、硼酸0.002 g，溶于馬鈴薯浸出汁酶解液并使用蒸餾水定容至1 L，用KH2PO4調(diào)節(jié)pH 6.8，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

玻璃層析柱(2.6 cm×60 cm和1.5 cm×75 cm)，北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；紫外分光光度計；傅立葉變換紅外光譜FTIR-650，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，美國Waters公司；ICS-5000離子色譜儀，美國戴安公司。

1.3 方法

1.3.1 根瘤菌胞外多糖的發(fā)酵與提取

種子液制備：以PDA培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，將活化的菌種按1%(體積分?jǐn)?shù))接入裝液量為100 mL的250 mL搖瓶中，于30 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

將發(fā)酵培養(yǎng)基加入10 L發(fā)酵罐中，裝液量為6 L，115 ℃滅菌20 min，冷卻至30 ℃時，接入5%(體積分?jǐn)?shù))的種子液，通入無菌空氣，攪拌速度為300～500 r/min，罐內(nèi)壓力為0.05 MPa，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵40 h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液使用蒸餾水(1∶1)稀釋后離心(8 000 r/min，20 min)去除菌體，上清液經(jīng)過減壓濃縮4倍后用3倍體積95%乙醇進行沉淀。將所得沉淀使用95%乙醇洗滌2次后,進行真空冷凍干燥得到粗多糖。

1.3.2 根瘤菌粗多糖的脫蛋白

將上述粗多糖配制成2 mg/mL的水溶液，使用木瓜蛋白酶與Sevage法進行脫蛋白[16]，加酶反應(yīng)完全后，加入Sevage試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)]∶多糖溶液=4∶1(體積比)，進行脫蛋白處理。利用Bradford法[17]與蒽酮-硫酸法[18]分別測定多糖溶液中蛋白質(zhì)含量和多糖含量。將處理后的多糖溶液通過減壓濃縮、醇沉處理后進行真空冷凍干燥，得到根瘤菌粗多糖。

1.3.3 根瘤菌粗多糖的分離純化

1.3.3.1 DEAE-52纖維素陰離子交換柱純化

將DEAE-52纖維素進行預(yù)處理[19]，濕法裝柱。稱取100.0 mg根瘤菌粗多糖，用去離子水配制成10 mg/mL多糖溶液。使用DEAE-52纖維素柱進行純化，上樣量為10 mL，分別用蒸餾水、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，收集各個不同組分，采用蒽酮-硫酸法檢測各管多糖含量，繪制多糖洗脫曲線。合并相同組分，50 ℃減壓濃縮后，分別用去離子水透析48 h后進行真空冷凍干燥。

1.3.3.2 Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱純化

分別準(zhǔn)確稱取10 mg上述真空冷凍干燥樣品并溶于2 mL蒸餾水中，使用Sephadex G-200柱(1.5 cm×75 cm)進一步分離純化(上樣量為2 mL，以蒸餾水洗脫，流速為0.2 mL/min)。以蒽酮-硫酸法進行逐一檢測，繪制多糖洗脫曲線，收集多糖濃度較高的洗脫液，經(jīng)真空冷凍干燥備用。

1.3.3.3 根瘤菌胞外多糖純度鑒定

將經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子交換柱和Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱純化后的多糖組分分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，在190～400 nm進行掃描，檢測在260～280 nm有無吸收峰，鑒定多糖的純度。

1.3.4 根瘤菌胞外多糖組分的結(jié)構(gòu)初步分析

1.3.4.1 根瘤菌胞外多糖分子量測定

采用高效液相色譜儀進行胞外多糖的分子量測定。色譜條件：色譜柱為UltrahydrogelTMLinear(300 mm×7.8 mm id×2)，配2414示差折光檢測器和Empower 3工作站。流動相為0.1 mol/L NaNO3，流速0.9 mL/min，柱溫45 ℃，進樣量20 μL。將收集的不同多糖組分分別溶解于流動相中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后依次進樣分析，采用GPC軟件計算其分子量。

1.3.4.2 根瘤菌胞外多糖的單糖組成分析

采用離子色譜儀進行多糖單糖組成分析。色譜條件：色譜柱為CarboPac PA20，檢測器為脈沖安培檢測器。流動相為250 mmol/L NaOH和1 mol/L CH3COONa進行梯度洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃。稱取5 mg多糖樣品于5 mL的具塞刻度試管中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸，121 ℃烘箱水解2 h，水解液除盡過量三氟乙酸后，用水定容至50 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾后供進樣分析。

1.3.4.3 根瘤菌多糖的紅外光譜分析

分別稱取1.0 mg多糖樣品與100.0 mg干燥KBr混合均勻后，充分研磨壓片后置于傅立葉紅外光譜儀中,在4 000～400 cm-1波段內(nèi)進行掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖的發(fā)酵與提取

利用10 L發(fā)酵罐控制發(fā)酵條件對根瘤菌進行放大培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)醇沉后，真空冷凍干燥得到粗多糖。根瘤菌胞外多糖的合成與細(xì)胞生長緊密相關(guān)，發(fā)酵至10 h時，細(xì)胞生長進入對數(shù)生長期，此時，胞外多糖開始大量積累；發(fā)酵至20 h時，菌體生長進入穩(wěn)定期，而胞外多糖的合成也趨于穩(wěn)定(圖1)。通過控制發(fā)酵條件，根瘤菌胞外多糖產(chǎn)量最高可達到28.2 g/L。

圖1 根瘤菌產(chǎn)胞外多糖過程變化曲線Fig.1 The process curve of extracellular polysaccharide production from Rhizobium

2.2 胞外多糖的脫蛋白處理

使用木瓜蛋白酶與Sevage試劑相結(jié)合的方法對根瘤菌胞外粗多糖進行脫蛋白處理，如圖2所示。隨著Sevage試劑脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白去除率明顯增強，經(jīng)過6次脫蛋白處理后，蛋白去除率達到94.61%，可以進行下一步分離純化。

圖2 酶與Sevage法結(jié)合對蛋白脫除率的影響Fig.2 Effect of enzyme combined with Sevage method on protein removal rate

2.3 胞外多糖的分離純化

2.3.1 DEAE-52纖維素柱純化

通過DEAE-52纖維素陰離子交換柱對根瘤菌胞外粗多糖進行初步分離純化。由于根瘤菌混合胞外多糖中存在不同極性的離子基團，所以隨著不同濃度洗脫液洗脫下來的多糖，極性也有所差異。本研究中，利用陰離子交換柱進行純化時，當(dāng)使用蒸餾水進行洗脫時，得到的EPS 1和EPS 2兩種組分應(yīng)為中性多糖[20]，而分別用0.1、0.3和0.5 mol/L NaCl溶液洗脫得到的EPS 3、EPS 4和EPS 5應(yīng)為酸性多糖(圖3)。收集各個組分洗脫液，減壓濃縮，透析后冷凍干燥，得到的多糖組分供下一步分離純化。

圖3 DEAE-52纖維素陰離子交換柱多糖梯度洗脫曲線Fig.3 The chromatography curve of polysaccharides by DEAE-52 cellulose column

2.3.2 Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱純化

經(jīng)DEAE-52纖維素陰離子交換柱分離得到的5種多糖組分，分別進一步使用Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱進行分離純化。經(jīng)蒸餾水洗脫后，5種多糖組分均為對稱單一的峰，如圖4所示，所得5種組分為較高純度的多糖組分。收集每個對應(yīng)峰洗脫液，經(jīng)真空冷凍干燥后，得到5種白色絮狀胞外單一多糖組分，分別命名為：EPS 1-1、EPS 2-1、EPS 3-1、EPS 4-1和EPS 5-1。

圖4 Sephadex G-200葡聚糖凝膠柱多糖洗脫曲線Fig.4 The elution curve of polysaccharides by Sephadex G-200 column

2.3.3 胞外多糖組分的純度測定

經(jīng)過分離純化后的5種根瘤菌胞外多糖組分經(jīng)紫外光譜掃描(圖5)，在260～280 nm沒有明顯吸收峰，說明經(jīng)純化后所得多糖相對較純，無明顯的核酸和游離蛋白質(zhì)等雜質(zhì)存在，可進一步分析。

圖5 根瘤菌胞外多糖的紫外光譜圖Fig.5 UV spectrum of extracellular polysaccharides ofRhizobium

2.4 胞外多糖組分結(jié)構(gòu)的初步分析

2.4.1 分子質(zhì)量測定

分離純化后所得5種根瘤菌胞外多糖組分經(jīng)高效凝膠過濾色譜分析，EPS 1-1的均重分子質(zhì)量最大為1.905×107Da；其次是EPS 2-1，為1.053×107Da； EPS 3-1、EPS 4-1和EPS 5-1三種胞外多糖組分的均重分子質(zhì)量較接近，分別為6.370×106、7.187×106和6.155×106Da(圖6)。

圖6 根瘤菌胞外多糖的高效凝膠過濾色譜圖Fig.6 High-efficiency gel filtration chromatogram oflextr- acellular polysaccharides from Rhizobium

2.4.2 單糖組成分析

經(jīng)離子色譜分析，混合單糖標(biāo)準(zhǔn)樣品對應(yīng)的出峰時間：(1)巖藻糖(Fuc)(t保留=2.217 min)，(2)鼠李糖(Rha)(t保留=4.25 min)，(3)阿拉伯糖(Ara)(t保留=4.467 min)，(4)半乳糖(Gal)(t保留=5.6 min)，(5)葡萄糖(Glu)(t保留=6.434 min)，(6)木糖(Xyl)(t保留=7.55 min)，(7)甘露糖(Man)(t保留=7.85 min)，(8)果糖(Fru)(t保留=9.05 min)，如圖7所示。純化得到的5種根瘤菌多糖組分水解后經(jīng)離子色譜分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品色譜圖進行比對，5種多糖組分中單糖組成含量及種類是有所差異的。如表1所示，EPS 1-1、EPS 2-1和EPS 5-1均主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，其摩爾比分別為1∶4.67∶2.35、1∶4.69∶4.33和1∶7.72∶1.69。此外，3種組分中還含有少量的巖藻糖、鼠李糖和阿拉伯糖等。EPS 3-1是由4種單糖組成，其主要單糖摩爾比為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖=1∶3.42∶4.77；EPS 4-1由3種單糖組成，摩爾比為半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖=1∶5.54∶1.9；根瘤菌胞外多糖的5個多糖組分主要都由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，但其摩爾比各不相同。每種單糖含量有差異，從而影響了其連接方式和結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)與生物活性又緊密相關(guān)，因此，研究根瘤菌單一胞外多糖組成成分分析，可以為后期根瘤菌單一胞外多糖的活性研究提供理論依據(jù)。

2.4.3 根瘤菌胞外多糖的紅外光譜分析

紅外光譜是檢測多糖結(jié)構(gòu)特征最常用的檢測方法。1 000～1 200、2 800～3 200和3 200～3 600 cm-1的吸收峰是多糖的曲型特征吸收峰。分離純化后的5種根瘤菌多糖組分的紅外光譜圖，如圖8所示。

a-單糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜圖；b-EPS 1-1的離子色譜圖；c-EPS 2-1的離子色譜圖；d-EPS 3-1的離子色譜圖；e-EPS 4-1的離子色譜圖；f-EPS 5-1的離子色譜圖圖7 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和根瘤菌胞外多糖離子色譜圖Fig.7 Ion chromatogram of monosaccharide standards and exopolysaccharide from Rhizobium

表1 根瘤菌單一胞外多糖的單糖組成及含量Table 1 Monosaccharide composition and content of a single exopolysaccharide from Rhizobium

單糖濃度/(mg·L-1)EPS 1-1EPS 2-1EPS 3-1EPS 4-1EPS 5-1巖藻糖(Fuc)0.1400.32000.104鼠李糖(Rha)0.4880.650.49300.474阿拉伯糖(Ara)0.2390.148000.094半乳糖(Gal)4.7824.885.9175.7312.392葡萄糖(Glu)22.33322.81220.23531.74518.455木糖(Xyl)00000甘露糖(Man)11.23321.04828.62510.8844.047果糖(Fru)00000Gal∶Glu∶Man?1∶4.67∶2.351∶4.69∶4.331∶3.42∶4.771∶5.54∶1.91∶7.72∶1.69

注：*指單糖組成摩爾比

圖8 根瘤菌單一胞外多糖的紅外光譜圖Fig.8 IR spectra of a single exopolysaccharide fromRhizobium

3 討論

通過對根瘤菌胞外粗多糖進行分離純化，得到EPS 1-1、EPS 2-1、EPS 3-1、EPS 4-1和EPS 5-1五種組分，并初步分析了5種多糖組分之間的差異性。結(jié)果表明，5種多糖組分均為β-型糖苷鍵連接的吡喃糖，其中EPS 1-1和EPS 3-1是β構(gòu)型的半乳吡喃糖；根瘤菌胞外多糖的5種組分主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖3種單糖組成，但它們的分子量和摩爾比卻不盡相同，從而可能會影響它們的生物活性。多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)和分子量有著密切關(guān)系[22-23]。不同分子量的多糖其結(jié)構(gòu)和生物活性大不相同，即使相同分子量的多糖，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)也可能不相同，這也是大分子物質(zhì)的復(fù)雜性和生物特性。不同的單糖組成影響多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，從而改變其生物生化特性[24]。例如，多糖組分中含有巖藻糖時能顯著促進RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放TNF-α細(xì)胞因子[25]。本文主要對根瘤菌胞外多糖的組分、分子量及單糖組成進行了研究。為進一步研究根瘤菌胞外多糖組分的糖重復(fù)單元、生物活性及其構(gòu)-效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。