膠紅酵母Rhodotorula mucilaginosa CICC 33013胞外多糖的分離純化及抗氧化活性研究

馬文錦，李梅林，王博，張永顯，于長青，班省華

(甘肅省輕工研究院有限責任公司，甘肅 蘭州，730030)

膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)是酵母種屬的1種，屬子囊菌門/隱形酵母科/紅酵母屬，是單細胞真核生物，在土壤、水和空氣中均有存在。酵母胞外多糖(YEPS)是酵母細胞在生長代謝過程中分泌到細胞壁外,常滲于培養基的一類糖類化合物[1]，具有潛在的抗氧化，抗凝血，抗血栓和抗病毒活性，可用于生產有機體免疫調節劑，具有廣闊的市場前景。迄今為止，已經報道了幾種酵母可以產生胞外多糖，其中包括：隱球菌屬(Cryptococcus)[2]，漢遜酵母屬(Hansenula)[3]，油脂酵母屬(Lipomyces)[4]，短梗霉屬(Aureobasidium)[5]和膠紅酵母屬(Rhodotorula)[6]。目前，國內外對細菌胞外多糖和一些大型真菌胞外多糖的研究較多，而對酵母胞外多糖的菌株篩選、多糖的結構解析和功能活性研究較少，尤其是膠紅酵母菌，屬于空白。

本文以膠紅酵母菌株R.mucilaginosaCICC 33013為研究對象，通過分離純化得到胞外多糖單一純品，并對其抗氧化活性做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

膠紅酵母菌株由中國典型培養物保藏中心提供；抗壞血酸、乙醇、三氯乙酸(分析純)，天津市天力化學試劑有限公司；酵母浸膏、蛋白胨(生物試劑)，北京雙旋微生物培養基制品廠；瓊脂粉(生物試劑)，北京奧博星生物技術有限責任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，安徽酷爾生物工程有限公司；ABTS，合肥博美生物科技有限責任公司。DEAE纖維素(DE-52),北京華中海威基因科技有限公司；葡聚糖凝膠(G-100),北京滿倉科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

CT15RT高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備有限公司；RE-3000旋轉蒸發器，上海市亞榮生化儀器廠；LCll00安捷倫液相色譜儀,安捷倫科技(中國)有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；EYELA冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；BSZ-1000自動部分收集器、HL-2恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；EM-30 Plus掃描電鏡，北京天耀科技有限公司；VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克光譜儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠紅酵母胞外多糖的制備

將膠紅酵母菌種接入平板活化后，轉入種子液培養基(酵母膏1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%)，在pH值為6的條件下培養2 d。隨后以5%的量轉入優化培養基(葡萄糖5%、(NH4)2SO40.1%、KH2PO40.1%、CaCl20.01%、NaCl 0.04%、MgSO4·7H2O 0.1%)，在28 ℃，pH 7的條件下，培養6 d。分離上清液與細胞，提取酵母胞外多糖。將液體培養液于9 000 r/min、4 ℃條件下離心6 min，分離酵母菌與培養液，濃縮液用4倍體積75%乙醇沉淀24 h，離心、冷凍干燥，得白色沉淀，即為酵母胞外多糖粗品。采用三氯乙酸法脫蛋白：稱取2.00 g的膠紅酵母胞外多糖樣品，蒸餾水復溶。在膠紅酵母胞外多糖的水溶液里緩慢滴加10%的三氯乙酸。置于4 ℃的冰箱內放置24 h，離心去除白色沉淀。將去除蛋白的多糖溶液醇沉后進行凍干處理，得到粗多糖REPS，保存后備用。

1.2.2 多糖含量的測定

采用苯酚硫酸法[7]。

1.2.3 膠紅酵母胞外多糖的分離、純化

1.2.3.1 DEAE-52纖維素層析柱純化

在原有方法[8]基礎上進行了修改，具體方法如下：將粗多糖REPS溶解于蒸餾水中，離心去除未溶解的沉淀與雜質，上清液用DEAE-52陰離子交換柱進行層析分離，依次用0.0，0.3，0.6，0.9和1.2 mol/L的NaCl以0.5 mL/min的流速洗滌，苯酚-硫酸法跟蹤檢測收集液，合并各洗脫峰洗脫液，濃縮，透析，冷凍干燥，備用。

1.2.3.2 Sephadex G-100凝膠柱層析

將DEAE-52纖維素柱層析分級得到的胞外多糖溶解，用滴管將多糖溶液沿壁緩慢地加入平衡好的SephadexG-100色譜柱中，蒸餾水洗脫，流速為0.5 mL/min，苯酚-硫酸法跟蹤檢測收集液，合并各洗脫峰洗脫液，濃縮，透析，冷凍干燥，備用，即得到多糖REPS純品。

1.2.4 多糖分子質量的測定和純度鑒定

將REPS純品組分采用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography, HPGPC)[9]測定純度和分子量。

1.2.5 紅外光譜測定

將多糖樣品用KBr壓片。通過Vector 33 FT-IR(fourier transform infrared spectrometer)分光光度計掃描，以4～400 cm-1的分辨率記錄2 cm-1的FT-IR光譜[10]。

1.2.6 多糖抗氧化性的研究

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力的測定

在WANG等[11]的方法上有所改動，具體操作如下：準確吸取DPPH試劑3.9 mL，與0.1 mL甲醇試劑混合，以甲醇作參照，記錄混合液于517 nm處所得的OD值(A對照)。吸取5份相同體積REPS純品組分溶液，分別稀釋到1、2、4、6和8 mg/mL；吸取5份相同體積的Vc溶液，分別稀釋到1、2、4、6和8 mg/mL。量取上述試樣各1 mL，加入3 mL DPPH(25 mg/L)試劑，渦漩均勻，30 ℃保溫，避光靜置40 min。甲醇為參照，記錄各混合液在517 nm處所得的OD值(A樣品)，所有的試樣做3個重復后求平均值。取上述樣液各0.1 mL，分別與3.9 mL甲醇試劑混合均勻，用甲醇做參照，記錄各混合液在517 nm處所得的OD值(A參比)；記錄各組數據，計算其清除率(percentage of scavenging radical capacity, SR)，得到清除率在一定濃度范圍內的線性回歸方程，通過線性回歸方程計算半數清除率IC50。

(1)

1.2.6.2 還原力的測定

在ZHU等[12]的方法基礎上稍作修改。具體操作如下：吸取5份同體積的REPS純品組分溶液，分別稀釋到1、2、4、6、8 mg/mL。移取不同濃度試樣0.4 mL，與磷酸鹽緩沖溶液(0.5 mL 0.2 mol/L，pH 6.6)和0.5 mL六氰合鐵酸鉀[K3Fe(CN)6](1.0%)溶液混合。反應混合物在50 ℃水浴保溫反應20 min后，快速冷卻，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，2 min后加入0.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3。室溫靜置5 min，在700 nm處測其OD值(A)。用蒸餾水代替0.1% FeCl3作為空白對照。

1.2.6.3 ABTS自由基清除實驗

在CHENG等[13]的方法基礎上稍作修改。具體操作如下：ABTS陽離子自由基(ABTS+·)通過將7.00 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液混合而產生，并在室溫下于黑暗中放置16 h。然后將3.6 mL的ABTS+溶液加入到0.4 mL不同質量濃度(1.0～8.0 mg/mL)的多糖組分REPS2-A中。將反應混合物在室溫下放置20 min，于734 nm處測量吸光度。以不同濃度Vc作為陽性對照。

ABTS自由基清除率按公式(2)計算：

模塊化設計以模塊為基礎，通過“搭積木”的方式將模塊組合成一系列標準化的模型，也可以在性能、結構上有所差異，充分適應不同用戶的需求。在建筑設計中，模塊化設計更傾向于對各類功能空間進行劃分，使相同功能空間處于同一單元當中，并對單元模塊進行集成，使建筑完成從單元到整體的轉變。目前，在許多公寓住宅、醫院、酒店、教學樓等建筑中得到了廣泛應用。

(2)

式中：A樣品，樣品吸光值；A對照，對照管的吸光值。

2 結果與分析

2.1 膠紅酵母細胞菌落形態

如圖1所示，在固體瓊脂培養基平板上的膠紅酵母(R.mucilaginosaCICC 33013)的菌落形態是均勻的，中等大小，暗紅色，具有光滑的表面。SEM圖像(圖1-b)顯示細胞形態為球形或橢圓形，3～4 μm，菌落分布為單個，配對或連環，出芽生殖。

a-膠紅酵母平板菌落形態；b- R. mucilaginosa CICC 33013細胞表面掃描電子顯微(SEM)圖像圖1 膠紅酵母細胞菌落形態Fig.1 R. mucilaginosa CICC 33013 cell colony and morphology

2.2 多糖含量的測定

葡萄糖標準曲線的回歸方程為：y=0.013 43x-0.106 7，線性相關系數R2=0.991 8。由葡萄糖標準曲線，可計算REPS產量為6.2 g/L。

2.3 胞外多糖的分離、純化

通過醇沉，脫蛋白，透析等方法得到粗多糖組分REPS，復溶，DEAE-52離子交換柱層析，由洗脫曲線可知，分別得到蒸餾水洗脫峰REPS1和REPS2，0.3 mol/L NaCl洗脫峰REPS3三個多糖組分(圖2)。將占主要部分的中性多糖REPS2用蒸餾水洗脫，并通過凝膠滲透在Sephadex G-100柱中進一步純化，分別得到了2個多糖組分REPS2-A和REPS2-B(圖3)。

圖2 REPS的DEAE-52纖維素柱層析洗脫曲線Fig.2 DEAE-52 cellulose column chromatography elution curve of REPS

圖3 REPS2的SephadexG-100凝膠柱層析洗脫曲線Fig.3 Sephadex G-100 gel column chromatography elution curve of REPS2

由于多糖組分REPS2-A占REPS2的75.2%(質量占比)，因此多糖組分REPS2-B未作研究。收集多糖組分REPS2-A，透析、干燥用于進一步分析。

2.4 多糖分子質量的測定和純度鑒定

HPGPC色譜圖顯示多糖組分REPS2-A是單一、對稱峰，表明得到的多糖組分REPS2-A是均相樣品。如圖4所示，根據葡聚糖標準，REPS2-A的平均分子質量為7.125×106Da。

LS-激光光反射強度；RI-示差強度圖4 REPS2-A分子質量分布圖Fig.4 The molecular weight distributions of REPS2-A

2.5 紅外光譜測定結果

圖5 REPS2-A紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of the REPS2-A fraction.

2.6 多糖抗氧化性的研究

2.6.1 DPPH清除活性分析

如圖6所示，隨著多糖組分REPS2和REPS2-A濃度的增加，DPPH清除作用呈劑量依賴性增加。當質量濃度為1.0 mg/mL時，多糖組分REPS2和REPS2-A的DPPH自由基清除能力分別為(25.05±1.60)%和(19.05±1.00)%。此外，多糖樣品在較高質量濃度(1.0～8.0 mg/mL)下表現出較高的清除能力。結果表明，多糖組分REPS2和REPS2-A具有較高的DPPH自由基清除能力，這意味著它們可以將電子或氫供給DPPH自由基。但是，粗多糖組分REPS對DPPH自由基清除能力的機制尚需進一步研究。

圖6 清除DPPH自由基能力測定結果Fig.6 DPPH radical scavenging activity of REPS2 and REPS2-A

2.6.2 ABTS清除率結果的測定

抗壞血酸、多糖組分REPS和REPS2-A對ABTS自由基的清除能力如圖7所示。多糖組分REPS2-A的清除能力與其濃度高度相關(濃度越高，清除能力越高)，但低于相同濃度的抗壞血酸。抗壞血酸濃度僅為1.0 mg/mL時，清除率已經高達90%，且隨著濃度增加，清除效果基本趨于平穩。REPS2-A和REPS在濃度達到8.0 mg/mL時表現出超過50.0%的ABTS自由基清除能力。結果表明，多糖組分REPS2-A和REPS對ABTS自由基具有清除能力，可作為潛在的抗氧化劑進一步研究。

圖7 清除ABTS自由基的能力Fig.7 ABTS radical scavenging capacity of REPS2 and REPS2-A

2.6.3 還原力實驗結果

還原力的活性可以有效地用于顯示抗氧化活性的能力。在反應中還原劑的存在導致Fe3+/鐵氰化物絡合物的還原，將其轉化為Fe2+形式，可以通過在700 nm形成普魯士藍來檢測[20-21]。本文比較了抗壞血酸，多糖組分REPS和REPS2-A的還原能力，如圖8所示，較高的吸光度表明較強的還原能力，有相互依賴性。當濃度為8.0 mg/mL時，抗壞血酸、多糖組分REPS和REPS2-A的最大還原力分別為2.789±0.030，0.710±0.040和0.352±0.010。當多糖組分REPS和REPS2-A組分的濃度逐漸增大時，兩者的還原力都在逐漸的增強，而多糖組分REPS的增加量大于REPS2-A，這說明經純化后的多糖組分REPS2-A組分其活性低于粗多糖組分REPS，這也與上述2種抗氧化活性試驗結果一致。

圖8 REPS2和REPS2-A的還原力Fig.8 Reducing power of REPS2 and REPS2-A

3 結論

本文主要對膠紅酵母R.mucilaginosaCICC 33013菌株代謝的胞外多糖REPS進行分離純化、初步結構解析及抗氧化活性分析等方面進行研究。結果表明：從R.mucilaginosaCICC 33013中分離出水溶性胞外多糖REPS，其產量為6.2 g/L。REPS經分離純化得到多糖組分REPS2-A，分子質量為7.125×106Da。通過不同方法的抗氧化能力體外測定(DPPH、ABTS、還原力)，證明REPS2-A具有較好的自由基清除能力，當多糖組分REPS2-A質量濃度為8 mg/mL時，DPPH自由基清除率為49.1%，ABTS自由基清除率為51.2%，還原力為0.352。多糖組分REPS2-A在各種反應體系中表現出不同的抗氧化活性，這可能與其特殊的結構和組成有關。研究表明，抗氧化活性的不同歸因于不同機制，例如防止鏈引發，過渡金屬離子催化劑的結合，過氧化物的分解，還原能力和自由基清除[22-25]。此外，研究發現，酵母多糖(如酵母多糖和顆粒葡聚糖)能夠刺激超氧化物的產生并減少由自由基或PMN白細胞誘導的DNA鏈斷裂[26]。然而，膠紅酵母胞外多糖REPS2-A的抗氧化機制尚不清楚，未來的研究主要集中在抗氧化機制與多糖組分REPS2-A結構之間的關系上。此外，多糖組分REPS2-A的體內抗氧化活性還有待進一步研究。