氧化葡萄糖酸桿菌產2-酮基-D-葡萄糖酸的發酵過程優化

蔡文，曾偉主，周景文

(國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconicacid，2-KGA)是一種重要的有機酸，用途廣泛[1]，能夠作為食品添加劑、水泥增塑劑、洗滌劑和照片顯影劑，最主要的用途是作為食品添加劑D-異抗壞血酸及其鈉鹽的前體[2]。此外，2-KGA還可以在2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶的作用下轉化成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-KDG)，2,5-KDG通過2,5-KDG還原酶可以生成用于維生素C合成的前體2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)[3]。2-KGA主要以化學法、酶催化法以及發酵法生產。化學合成法以Pt/Pb為催化劑，催化D-葡萄糖與分子氧反應形成2-KGA；酶法是指在相關氧化酶的催化作用下，將溶液中的D-葡萄糖經多步氧化形成2-KGA；發酵法是通過細菌發酵直接將D-葡萄糖轉化為2-KGA，當前，普遍應用于工業生產2-KGA的方法為細菌發酵法。主要的細菌有熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、球狀節桿菌、產酮產堿菌、巴氏醋酸桿菌、氧化葡萄糖酸桿菌、粘質沙雷氏菌等[4-7]。我國的工業生產以熒光假單胞菌為主，在以18%的葡萄糖溶液為底物時，最終的轉化率可達90.0%。但是熒光假單胞菌作為生產菌株，存在生產過程噬菌體污染、高濃度底物對發酵過程中菌體生長的抑制和發酵液中成分過多，分離困難等問題。

本研究中采用的菌株為氧化葡萄糖酸桿菌[8]，具有耐高滲、耐酸等特點，同時對葡萄糖的利用率較高，因此可以用作生產2-KGA的菌株。本實驗主要對5株野生菌進行初步篩選，針對具有較強2-KGA積累能力的菌株進行發酵優化，包括搖瓶培養的溫度、培養基的組成以提高2-KGA的產量。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

GluconobactercerinusCGMCC 1.110[9]、Glucono-bacterjaponicusCGMCC 1.49[10]：中國普通微生物菌株保藏中心；Gluconobacteroxydans621H[11]：美國模式培養物集存庫(ATCC)；GluconobacteroxydansWSH-003[12]：江蘇江山制藥有限公司；GluconobacteroxydansT-100：日本NBRC菌株保藏中心。

1.1.2 主要試劑

頭孢西丁鈉鹽、卡納霉素抗生素，阿拉丁生物；蛋白胨、酵母粉，Oxoid生物。其他常規試劑購自國藥試劑。

1.1.3 培養基

種子培養基(g/L)：酵母抽提物10，山梨醇50，相應的固體培養基加入2%瓊脂條，115 ℃滅菌20 min。

搖瓶發酵培養基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿粉20，CaCO320，MgSO40.2，(NH4)2SO42，KH2PO40.5，115 ℃滅菌20 min。

3 L發酵罐發酵培養基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿粉20，CaCO30.1,MgSO40.2,(NH4)2SO42，KH2PO40.5，115 ℃滅菌20 min。

1.1.4 儀器與設備

高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊實業有限公司；恒溫搖床,上海知楚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子活化

從冰箱中取出保存的菌株甘油管解凍后，用接種針蘸取菌液劃線于平板上，放置于30 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，挑取平板上的單菌落于裝有種子培養基的搖瓶中，放置于30 ℃恒溫搖床中，220 r/min培養24 h。

1.2.2 細胞培養

搖瓶培養：將活化后的種子液以10%接種量轉接至裝液量為50 mL的500 mL搖瓶中，30 ℃下220 r/min培養24 h。

發酵罐培養：以10%接種量將培養好的種子液轉接到3 L發酵罐中，裝液量為1 L，攪拌轉速600 r/min，通氣量4 vvm，30 ℃下培養。

1.2.3 檢測方法

采用高效液相色譜法(HPLC)測定發酵液中的2-KGA含量。利用AMINEX HPX-87H有機酸柱進行檢測，檢測條件為：流動相0.5 mmol/L稀H2SO4溶液，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

標準曲線的繪制：將購買的標準品溶于純水中，按照一定比例稀釋成不同質量分數的溶液后，以液相檢測的峰面積為Y軸，標準品濃度為X軸，繪制標準曲線，得到液相檢測的峰面積與產物濃度的關系。

1.2.4 最終轉化率計算

(1)

2 結果與分析

2.1 高產2-KGA菌株篩選

本實驗室保藏的菌株共5株:G.cerinusCGMCC 1.110、G.japonicusCGMCC 1.49、G.oxydans621H、G.oxydansWSH-003 和G.oxydansT-100。分別以這5株野生菌作為出發菌株進行搖瓶發酵，以葡萄糖質量濃度為50 g/L的培養基為底物發酵，催化生產2-KGA。通過液相色譜檢測產量進行對比，篩選出1株高產菌株作為后續發酵優化的出發菌株。從圖1可以看出，在這5株野生菌中，G.japonicusCGMCC 1.49的產量最高，為19.9 g/L，轉化率為36.9%，將其作為后續研究的出發菌株。

A-G. oxydans WSH-003；B- G. oxydans 621H；C-G. japonicusCGMCC 1.49；D-G. cerinus CGMCC 1.110；E-G. oxydans T-100圖1 五株出發菌株發酵產量對比Fig.1 Comparison of 2-KGA titer of 5 starting strains

2.2 搖瓶發酵條件優化

2.2.1 葡萄糖質量濃度對發酵的影響

氧化葡萄糖酸桿菌中含有較多的脫氫酶，不同的底物可以被特異性催化生成不同的代謝產物[13]。以葡萄糖為底物時，產物為酮基葡萄糖酸，包括2-KGA和5-酮基葡萄糖酸(5-KGA)以及2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-KDG)[14]。本實驗中，確定以葡萄糖作為底物，探究不同濃度的底物對發酵以及產率的影響。

A-不同底物濃度對應的生長曲線；B-不同底物濃度條件下的2-KGA產量圖2 葡萄糖濃度對發酵過程的影響Fig.2 Effects of glucose concentrations on fermentation process

從圖2和表1中可以看出，培養基中的葡萄糖濃度不同，對于發酵過程中菌體的生長量、生長速率和2-KGA的產量有一定影響。當培養基中的葡萄糖質量濃度為50 g/L和100 g/L時，菌體的生長速度較快，最大的OD600值分別為12.5和13.7，可以看出當葡萄糖初始濃度較小時，有利于菌體的生長，生長速率較快；濃度較高時，對菌體的生長有較大的抑制作用，導致最終的菌體量較小。綜合考慮菌體的生長速率、產量以及轉化率，選取底物質量濃度為100 g/L作為發酵的初始濃度。

表1 初始葡萄糖濃度對發酵的影響Table 1 Effect of initial glucose concentration onfermentation process

2.2.2 氮源種類以及最優氮源濃度對發酵的影響

本實驗選取的氮源有硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、尿素、玉米漿粉、酵母粉和牛肉浸膏，添加量均為10 g/L，發酵72 h后，對比2-KGA的產量，確定最佳氮源[15]。從圖2-A中得出，以玉米漿粉作為氮源時，對比生長情況在各個氮源種類中最佳，發酵72 h后，2-KGA產量為23.8 g/L，轉化率為44.2%。在所選氮源中，最終的產率最高。

在確定最佳的氮源為玉米漿粉后，對玉米漿粉添加量進行優化。選取5個濃度梯度進行發酵驗證。不同玉米漿粉質量濃度對菌體的生長和產物的合成都有一定的影響，通過圖3-B中比較可以得出玉米漿粉的最優添加量為20 g/L。

A-不同氮源對2-KGA產量及菌體生長的影響；B-玉米漿粉添加量對2-KGA產量及菌體生長的影響圖3 氮源及最佳氮源添加量對2-KGA的產量以及菌體生長的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources and optimum nitrogen sources on titer of 2-KGA and growth of strain

2.2.3 溫度對發酵的影響

氧化葡萄糖酸桿菌中已知的相關酶類的性質，主要涉及的葡萄糖脫氫酶和葡萄糖酸-2-脫氫酶最適溫度與菌體生長的最適溫度有差別，所以本實驗對不同溫度條件下的發酵情況進行比較[13,16-17]。主要控制發酵溫度在28～32 ℃范圍內，以50 g/L底物質量濃度發酵，控制其他條件相同，比較菌體的生長和最終產率情況。從圖4可以得出，同一批次中，當控制發酵溫度在30 ℃時，菌體的生長速度較快，發酵至終點的菌體量及最終的產率最高，產量達到23.7 g/L，轉化率為49.6%。

A-溫度對2-KGA產量的影響；B-不同溫條件下的生長曲線圖4 溫度對發酵過程的影響Fig.4 Effects of temperature on fermentation process

2.3 3 L發酵罐實驗

2.3.1 初始pH值對發酵的影響

通過在搖瓶上對發酵條件的摸索，確定培養基的基本組成，在發酵罐中對搖瓶實驗進行放大[1,18]。在摸索搖瓶發酵條件時，對pH值條件的摸索受到限制，主要通過碳酸鈣的添加來維持搖瓶中的pH值，在發酵罐上主要采用50%的氨水溶液進行pH值的調節。在搖瓶上進行發酵時，對比不添加碳酸鈣進行發酵，最終的發酵液的pH值僅為2.8左右，且檢測不到產物。所以猜想，在發酵過程中如果pH值一直維持較低水平，不利于產物的產生。當初始pH值為4.0或更低時，菌體的生長受到了很大抑制，所以需要在發酵罐上對發酵過程中的pH值進行調控。本實驗主要選取了pH值為5.0、6.0、7.0進行對比。

對比圖5不同pH條件下的發酵情況發現，當控制發酵過程中的pH值為6.0，發酵時間達到60 h時，產量最高達到93.4 g/L，轉化率為87.2%。在該條件下，菌體的生長狀況最好，所以在后續的發酵實驗中，控制pH值為6.0。從葡萄糖消耗速率與中間產物葡萄糖酸的產生速率來看，前24 h內，底物被快速消耗，大部分轉化為中間產物葡萄糖酸，菌體持續快速生長。經歷了前24 h后，菌體量保持增加，底物逐漸消耗盡，中間產物開始轉化為終產物2-KGA。另外檢測發酵過程中溶氧發現，在0～36 h內變化劇烈且出現最低值，說明此階段菌體生長旺盛，耗氧量增加。36 h后，溶氧開始慢慢上升，發酵持續到42 h后，溶氧水平保持平衡，菌體生長開始放緩。后續發酵罐上的溶氧水平優化可以此作為參考。

圖5 pH對發酵過程的影響Fig.5 Effects of pH on fermentation process

2.3.2 溶氧對發酵的影響

溶氧(DO)是好氧微生物生長所必須的條件，更是對產物生成和能量代謝產生影響的關鍵環境因素之一。溶氧作為發酵過程中的重要參數，對發酵生產的穩定性和生產成本具有重大影響。在研究確定了最佳的pH值后，繼續對溶氧進行探究。通過前期對罐上發酵過程的溶氧水平進行監測可知，在接種后的0～24 h內，溶氧量劇烈波動不斷下降，最低降為0且維持一段時間；在36 h后，溶氧水平慢慢回升至最高值后維持恒定。所以本實驗中對發酵前36 h內控制溶氧條件分別為20%、30%、40%和50%由圖6可知，隨著DO的升高，菌體生物量逐漸升高，至DO為40%時達到最大。當DO上升至50%時，菌體的生長量反而減小，同時當控制DO為30%時，2-KGA產量達到最大，且此條件下的產率也達到最高，分別為97.3 g/L和90.3%。雖然氧化葡萄糖酸桿菌是好氧菌，但是過多的氧氣容易引起超氧化物和羥基自由基等物質形成，破壞細胞的組成，從而對菌體自身的代謝產生影響。

圖6 不同DO水平對發酵過程的影響Fig.6 Effects of different DO levels on fermentation process

2.3.3 一次性補料時殘糖質量濃度對發酵的影響

本實驗采用3 L自動發酵罐進行2-KGA的分批補料發酵實驗，初始的葡萄糖質量濃度均為100 g/L，裝液量為1 L。發酵過程中以發酵液中的殘糖質量濃度為指標，分別選取殘糖質量濃度降低至15、25、35和45 g/L四個水平，一次性補加葡萄糖250 g/L，補糖量為200 mL，再以同樣的條件發酵至終點。在發酵開始后10～18 h內，每1 h取樣1次，監測殘糖質量濃度，確定補料時機，補料之后每6 h取樣1次。

殘糖質量濃度分別為：A-15 g/L;B-25 g/L;C-35 g/L;D-45 g/L圖7 殘糖質量濃度對生長的影響Fig.7 Effect of residual sugar concentration on growth

由圖7可知，在不同的殘糖質量濃度下，一次性添加50 g葡萄糖補料發酵，有利于減弱底物抑制，避免快速利用碳源的阻遏效應；補料發酵還可以控制最佳的生長和產物合成條件，穩定生產工藝。在25 g/L和45 g/L時一次性補料，菌體生長較旺盛，在對數生長期比生長速率較快，且能獲得較高的菌體濃度。結合在發酵過程中的葡萄糖消耗、中間產物以及2-KGA生成的速率分析，在殘糖質量濃度為35 g/L和45 g/L時一次性補料后底物的消耗以及產物的形成速率較快。殘糖質量濃度為35 g/L時一次性補料，最大的生產強度為4.33 g/(L·h)，發酵92 h后產量最終達到112.1 g/L；而殘糖質量濃度為45 g/L時，最大的生產強度為6.16 g/(L·h)，發酵92 h后產量最終達到122.1 g/L。同時，當選擇殘糖質量濃度為45 g/L時進行補料，最終發酵液中殘留的葡萄糖酸最少，給后期產物提純帶來的影響較小。在15 g/L和25 g/L時進行補料，菌體生長較慢，2-KGA產量較低，生產強度和底物利用率不高。綜合產物得率以及轉換率對比得出，在殘糖質量濃度為45 g/L時一次性補料后，菌體生長較好，產物轉化率和生產強度最高，分別為75.5%和6.16 g/(L·h)，產量較分批發酵提高了43.5%。

3 討論

本文從5株菌中篩選出最適菌株G.japonicusCGMCC 1.49，并對其產2-KGA的發酵工藝進行了優化，在此最適條件下，2-KGA搖瓶發酵最高產量為76.3 g/L，較優化前提高了120.0%。對3 L罐中生產2-KGA的最優pH值和溶氧條件進行探究，得到在pH值為6，DO為30%條件下，2-KGA的產量為97.3 g/L，較搖瓶最高水平提高了26.7%。通過一次性補料優化后，產量達到122.1 g/L，轉化率達75.5%。在后期的研究中，可以通過對補料方式和補料時機進一步探究，完善氧化葡萄糖酸桿菌產2-KGA過程中的各項參數，實現高產2-KGA的目標。本文篩選最適菌株后主要通過發酵優化手段實現2-KGA的高產，沒有對其進行分子改造。最終結果表明，潛在副產物5-KGA和2,5-DKG的含量極低，對后期的分離提純影響較小。近年來，對氧化葡萄糖酸桿菌的基因操作手段日趨完善[13,19-21]。在后續工作中，通過代謝工程策略強化2-KGA合成的關鍵酶、優化補料發酵條件，將有望進一步提升2-KGA產量[22-23]。本研究為后續利用氧化葡萄糖酸桿菌發酵生產2-KGA，及利用代謝工程改造實現維生素C前體2-KLG的直接發酵提供理論與技術參考[24-25]。