海洋細菌低溫葡萄糖氧化酶基因克隆及其在大腸桿菌中的表達

劉春瑩，胡善松，張慶芳，李美玉，于爽，遲乃玉*

1(大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連，116622) 2(遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連，116622)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)的系統名稱為β-D-葡萄糖氧化還原酶(E.C.1.1.3.4)[1]，最先于1904年在黑曲霉和灰綠青霉中發現[2-4]。它能夠催化β-D-葡萄糖被氧化成葡萄糖酸-δ-內酯，進而被水解成葡萄糖酸，并生成過氧化氫[5]。因此，GOD因其具有脫氧和防腐的功能，而應用在食品保鮮方面。GOD還具有消除腸道病原菌、解除腸道霉菌毒素中毒、改善腸道酸性消化環境、保護腸道上皮完整的功能[6-7]，被廣泛應用在畜牧業和養殖業[8-9]。由于GOD的專一氧化葡萄糖的特性，在生物傳感器、醫學檢驗等領域是重要分析用酶[10-13]。

野生菌株中GOD活力較低，利用基因工程進行改造成為一種有效的手段。20世紀KOVACEVIC等[14]與GUO等[15]在畢赤酵母中成功表達黑曲霉GOD。PULCI等[16]也將青霉GOD的基因成功克隆到酵母中并實現表達。隨著GOD需求的增加，我國相關研究也逐漸增多。周亞鳳等[17]將黑曲霉GOD基因克隆到酵母中并高效表達。高慶華等[18]也將青霉GOD基因克隆到酵母中并表達。大腸桿菌一直作為外源蛋白表達的首選系統[19]，但很少應用在GOD外源表達方面。現有報道僅WITT等[20]及顧磊等[21]嘗試在大腸桿菌中表達黑曲霉GOD。細菌與大腸桿菌的同源性更高，可能更適合在大腸桿菌中表達，但此類的研究此前未見報道。

本研究以海洋細菌Citrobacterssp. 8-III為出發菌株,采用E.coliBL21(DE3)為表達宿主，構建GOD高產大腸桿菌工程菌株，實現GOD在大腸桿菌中的高效表達，并對重組GOD酶學性質進行分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

Citrobacterssp. 8-III：遼寧省海洋微生物工程中心提供(分離自大連渤海海域，深度約30 m的海泥中。)；E.coliDH5ɑ：構建和克隆目的基因；E.coliBL21(DE3)：表達宿主；質粒pMD9-T：克隆載體；質粒pET-28a(+)：表達載體。

1.1.2 試劑與儀器

PCR相關試劑、克隆相關試劑和限制性內切酶：Takara公司；PCR產物純化試劑盒等：上海生工生物有限公司；瓊脂糖、辣根過氧化物酶和鄰聯茴香胺等試劑：Sigma公司。

PCR儀和電轉化儀，Eppendorf公司；Multiskan1510酶標儀，Thermo Fisher Scientific；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；LTI-700恒溫培養箱，上海愛郎儀器有限公司；HZP-250全溫振蕩培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；HD-1360 超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；AL-204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀，北京榮陽靜電科技有限公司

1.1.3 培養基

LB培養基：10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨；種子培養基：10 g/L蛋白胨、5 g/L牛肉膏、10 g/L NaCl；發酵培養基：60 g/L葡萄糖、3 g/L蛋白胨、2 g/L K2HPO4、0.7 g/L MgSO4、0.5 g/L KCl、4 g/L NaNO3，pH 6.5。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株8-III GOD基因的獲取

挑取菌株8-III的單菌落于8 mL種子培養基,于25 ℃下160 r/min振蕩培養48 h，以2%的接種量接種到含有100 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，160 r/min，25 ℃搖床中培養48 h。取2 mL的菌液于8 000 r/min離心，去掉上清液，用PBS洗滌2次，再次離心收集菌體。利用基因組大量提取試劑盒(powermax TMSoil DNA isolation kit)提取基因組DNA。所提DNA送到北京百邁克生物科技有限公司進行DNA質量檢測，并使用Illumina Hiseq X10高通量測序平臺進行雙端測序(PE150)，得基因組草圖。對測序數據過濾低質量后，利用Velvet軟件[18]進行初步組裝，得到最終基因組框架圖(draft genome)。根據GenBank公布GOD基因序列通過BLAST比對確定目的基因。交由Synbio Technologies公司對8-III菌株的GOD基因進行基因全長合成，并構建于克隆載體pMD-9-T，命名pMD-9-T-GOD。

1.2.2 目的基因的克隆

5′端引物序列P1為：5′-ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA-3′，其3′端引物序列P2為：5′-CTAGGCACTTTTGGCA-TAGTCTTCA-3′，用這對引物以pMD-9-T-GOD為模板進行PCR擴增。反應體系為50 μL：基因組DNA 100 ng，引物各0.2 μmol/L，dNTPs 250 μmol/L，5×Q5高保真DNA聚合酶緩沖液10 μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5 μL。PCR反應條件：98 ℃、5 min；98 ℃、 30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、60 s，共30個循環；72 ℃、10 min。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定純度和分子量的大小。PCR產物經DNA回收試劑盒回收。

1.2.3 原核表達載體的構建

將pET-28a(+)用NcoⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，與目的基因連接，重組質粒命名為pET-28a(+)-GOD。該表達質粒的構建方式刪除了pET-28a(+)質粒載體上的全部標簽，可用來構建無標簽的基因表達工程菌。將該表達質粒轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞，陽性的轉化菌命名為E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-GOD。送至Synbio Technologies公司測序驗證，保存測序正確的菌株。

1.2.4 目的蛋白的誘導表達與純化

將E.coliBL21/pET-28a(+)-GOD接種于10 mL含卡那霉素的LB液體培養基中，160 r/min，25 ℃，過夜培養。取上述菌液按2%接種量接種于100 mL含卡那霉素的LB液體培養基中，160 r/min，25 ℃培養4 h，加入IPTG誘導表達。收集菌體發酵液于10 000 r/min，4 ℃，離心20 min，棄上清。菌體沉淀以pH 7.4的PBS洗滌，重復洗滌3次。洗滌后用10 mL的PBS重懸。將重懸液超聲裂解15 min(開3 s，間隔5 s，功率200 W)。將裂解液以10 000 r/min，4 ℃，離心20 min，上清液為粗酶液。粗蛋白用Ni2+-NTA柱(Novagen)進行親和層析純化，洗脫的蛋白液4 ℃保存，蛋白樣品經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，同時以空載體和未誘導作對照，記錄并分析結果。

1.2.5 酶活力測定[22]

于96孔板中依次加入5%葡萄糖溶液150 μL，鄰聯茴香胺溶液150 μL，辣根過氧化物酶溶液10 μL，25 ℃反應10 min，加入待測液10 μL。酶標儀波長460 nm，每間隔1 min測定1次，共測定5次。以在25 ℃，pH 6.5的磷酸緩沖溶液的反應條件下，每分鐘將1 μmol的葡萄糖催化氧化為葡萄糖酸和過氧化氫所需要的GOD的量定義為1個GOD的活力單位。根據公式計算酶活[19]。

1.2.6 酶學性質研究

溫度對重組GOD影響：將適當稀釋的酶液分別在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60和65 ℃下進行反應，以酶活最高者為100%計算相對酶活，從而確定該酶的最適作用溫度。將適當稀釋的酶液分別放到0、10、20、30、40、50和60 ℃下保溫1 h，每隔30 min取樣，在冰上放置5 min后進行酶活測定。以未進行熱處理的酶液的酶活為100%計算相對酶活，確定重組GOD的熱穩定性。

pH值對重組GOD影響：配制pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的PBS緩沖體系，將酶液分別用這些緩沖液稀釋后進行反應，以酶活最高者為100%計算相對酶活，從而確定GOD酶的最適pH值。分別將酶液在pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的PBS緩沖液中保溫30 min(溫度為25 ℃)，以未經保溫處理的酶活為100%計算殘余酶活力，從而確定GOD酶的pH穩定性。

金屬離子對酶活影響：在GOD酶與其底物進行反應的體系中，加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+及乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，使其終濃度為0.35 mmol/L，然后按照1.2.5的方法進行酶活測定。以不加金屬離子的反應體系的酶活定義為100%，表示不同金屬離子或化合物下的相對酶活。

1.2.7 雞飼料的應用

將重組GOD純化后與SiO2以4∶1比例復配后,以0.05%加入雞飼料中，喂養A組雛雞;只加入GOD未與SiO2復配的雞飼料喂養B組雛雞;以未加入GOD的雞飼料喂養C組雛雞。每組12只，喂養14 d，記錄平均每日增重、平均每日攝取量、飼料利用率和腹瀉率。

1.2.8 幼犬飼料保鮮

將重組GOD純化后與SiO2以4∶1比例復配后，以0.05%加入幼犬飼料中，為實驗組A；以陸生霉菌GOD與SiO2以4∶1比例復配后，以0.05%加入幼犬飼料中，為實驗組B；以未加入GOD的幼犬飼料為實驗組C。每組50份0.5 kg飼料，4 ℃儲藏14 d，記錄飼料霉變情況。

2 結果與分析

2.1 目的基因PCR擴增

以pMD-9-T-GOD為模板PCR擴增GOD基因，見圖1。

M-DNA Marker；1～4-PCR擴增產物圖1 目的基因克隆PCR電泳檢測結果Fig.1 PCR assay of the targetgene

目的基因條帶單一、濃度較高。經測序其全長為1 292 bp，提交至Genbank所獲序列登錄號是MK054202，與Genbank中其他GOD基因序列的相似度在92%～98%，預期能夠編碼含有428個氨基酸殘基的蛋白質。對序列進行分析，發現序列中不含有內含子和基因原有的信號肽序列，不含有SacⅠ、NotⅠ和SnabⅠ酶切位點，含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點，符合之前的預測。

2.2 重組表達載體的構建

分別用NcoⅠ和XhoⅠ對pET-28a-GOD做分步酶切，預期得到大小分別為5.4 kb的載體片段和1.3 kb的目的基因片段。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產物進行檢驗，結果見圖2。泳道1為重組質粒的酶切鑒定結果，大小與預期結果一致，將鑒定正確的質粒進行測序，最終確定重組表達質粒pET28a-GOD。

M-DNA Marker；1-酶切處理的質粒；2-質粒DNA圖2 重組質粒pET-28a-GOD的酶切鑒定Fig.2 Restriction pattern of recombinant pET-28a-GOD

2.3 誘導表達與純化

將經鑒定正確的原核重組表達質粒載體pET28a-GOD轉化至表達宿主菌E.coliBL21(DE3)中誘導表達。通過SDS-PAGE分析目標蛋白表達情況。加入IPTG后成功誘導外源蛋白的表達。以沒有裝載GOD的E.coliBL21/pET28a菌體作為對照，在E.coliBL21/pET28a-GOD菌體裂解液全菌、上清液和沉淀的約46 kDa位置出現一條蛋白帶(圖3)，該蛋白帶分子質量與重組GOD的理論分子質量(46 kDa)相一致，由此推測該蛋白帶為誘導表達的GOD。此外，由圖(圖3泳道2)可見菌體裂解后的可溶部分也檢測到GOD蛋白條帶，說明克隆菌株不僅能有效表達GOD，而且重組GOD為可溶性表達。

2.4 NI+-NTA柱親和純化

通過Ni+-NTA親和層析柱進行GOD純化，SDS-PAGE檢測洗脫收集液，如圖4所示。目標蛋白被150 mmol/L和200 mmol/L咪唑溶液洗脫下來，大小在46 kDa左右，且洗脫液中雜蛋白較少。

M-標準蛋白；1-E. coli BL21/pET28a-GOD菌體裂解液沉淀；2-E. coli BL21/pET28a-GOD菌體裂解液上清液；3-E. coli BL21/pET28a-GOD菌體裂解液全液；4-E. coli BL21/pET28a(+)菌體裂解液上清液圖3 目的蛋白GOD的SDS-PAGE檢測結果Fig.3 SDS-PAGE analysis of GOD protein

M-蛋白質分子量標準；1-150 mmol/L咪唑溶液洗脫目標蛋白；2-200 mmol/L咪唑溶液洗脫目標蛋白圖4 純化后E. coli BL21/pET28a-GOD的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of E. coli BL21/pET28a-GOD after purification

2.5 酶學性質分析

2.5.1 酶最適作用溫度

將重組GOD在10～60 ℃處理5 min，結果如圖5-a所示。酶的最適反應溫度為25 ℃，20～35 ℃相對酶活可以保持在80%以上，40 ℃后相對酶活快速降低。此外該酶在0 ℃時可保持50%相對酶活，符合海洋細菌低溫酶特性，在較短的時間產生大量GOD。如圖5-b所示，10～35 ℃時，相對酶活可保持80%以上，表明在該溫度范圍內酶的溫度穩定性良好，其中25 ℃酶活最穩定，相對酶活保持在90%以上，40 ℃后穩定性迅速下降。該酶在0 ℃時可保持60%以上酶活力且穩定性快速提升，10 ℃后可達到60%以上酶活力，說明該酶具有低溫酶特性，且溫度穩定性良好。

a-酶最適作用溫度；b-酶的溫度穩定性圖5 溫度對酶活影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

2.5.2 酶最適作用pH

如圖6-a所示，重組GOD的最適pH值為6.0，在pH值為5.5～6.5時，保持85%以上的相對酶活，表明該酶屬于偏酸性GOD。如圖6-b所示，該酶在pH 6.5時穩定性最好，在pH 6.0～7.0時相對酶活可保持80%以上，pH 7.5以后穩定性快速降低。推測GOD中可能存在酸性基團，堿性條件下不能穩定存在。在pH 7.5以上會產生結構變化，影響酶活。

a-最適pH值; b-pH穩定性圖6 pH對酶活影響Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

2.5.3 金屬離子及螯合劑對酶活的影響

由圖7可知，K+、Ni2+對重組GOD的活性有明顯促進作用；Na+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Ag+、Ca2+、Fe2+、Mg2+和EDTA對GOD活性有抑制作用，其中Cu2+、Ag+、Ca2+、Fe2+和Mg2+嚴重抑制重組GOD酶活性。推測這可能是由于這些離子與酶中心的功能基團結合，進而引起酶失活。

圖7 金屬離子及螯合劑對酶活力的影響Fig.7 Effects of metalions and chelating agents on enzyme activity

2.6 雞飼料中應用

將重組GOD添加到雞飼料中，飼養結果如表1所示。A組雛雞的平均日增和飼料利用率重要大大高于B、C兩組，其中B組又比C組要高。腹瀉率C組最高，A組最低。結果表明，重組GOD可以通過改善腸道菌群提升對飼料的有效吸收，從而提升雞體重。此外，重組GOD需要與相應載體聯合使用，單獨使用重組GOD效果并不理想。

表1 重組GOD在雞飼料中應用Table 1 Application of recombinant GOD in chicken feed

2.7 幼犬飼料中應用

重組GOD添加到幼犬飼料中，結果如圖8所示。A組的霉變情況最好，C組最差，B組稍好于C組。說明重組GOD確實具備防腐的作用，并且在低溫環境也能有很好的作用，這是陸地來源GOD所不具備的。

圖8 幼犬飼料霉變情況Fig.8 Mildew of puppy feed

3 結論

GOD是一種重要的應用酶，國內外學者在其外源表達方面已進行大量研究[22-26]。葡萄糖氧化酶最適作用溫度為40～45 ℃，在35～50 ℃酶活穩定，屬于中高溫酶。本文首次嘗試將海洋細菌GOD基因在大腸桿菌中表達，并將酶活提升2.72倍。重組GOD分子質量為46 kDa，在25 ℃，pH 6.5的環境下酶活最高，10～20 ℃酶活保持穩定。結果表明，重組GOD具備低溫酶特性，可以填補傳統陸地來源GOD在飼料保鮮等方面的不足。此外大腸桿菌可用于細菌GOD外源表達。同時，克隆菌株自身具有培養條件簡單經濟、生長繁殖快速、蛋白表達水平高等優勢、遺傳背景清晰、基因改造工具多樣等特點[15]，與工業生產相契合。

將重組GOD添加到動物飼料中，可起到防腐作用，并提升飼料利用率。重組GOD通過殺滅或抑制病原微生物的生長繁殖維持動物腸道菌群平衡，自身及代謝產物對動物和環境均無毒副作用，且不易誘發耐藥菌產生，也不易誘發交叉耐藥菌的產生，具備加工為飼料添加劑的潛力。此外，已報到的GOD飼料添加劑絕大多數自身不具備防腐功效[27-28]，重組GOD的低溫酶特性，可填補傳統GOD在低溫領域的空白。在食品保鮮與以低溫檢測方面有良好的應用前景。