重組牛乳鐵蛋白功能片段在畢赤酵母中的表達及高密度發酵

魏春，任鄭，吳濤，錢曉芬，孫杰，汪釗

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州，310014)

牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin, Blf)是一種非血紅素鐵結合蛋白，分子質量為77 kDa，是由689個氨基酸組成的單一多肽鏈，具有廣譜的抗菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤及參與免疫調節等多種生物學活性[1-9]，在食品添加劑、飼料添加劑、醫藥、化妝品行業中具有廣闊的應用前景。我國已將其列入GB14880—2012，認定其為食品營養強化劑。牛乳鐵蛋白抗菌機制主要是牛乳鐵蛋白水解產生的2個小肽的作用[10-11]。這2個小肽位于N末端上的17～30位和265～284位2個氨基酸結構域[12-14]，而且這2個小肽在空間結構上很相近，2個結構域相互協作起作用，這比單一結構域具有更強的抗菌活性[15]。牛乳鐵蛋白目前主要從牛乳中提取，生產成本高。微生物發酵法是一種降低牛乳鐵蛋白生產成本的極具潛力的方法。目前，牛乳鐵蛋白已經在大腸桿菌中得到表達[16]，但容易形成包涵體，無法應用于工業生產。畢赤酵母表達系統生長快，易于高密度發酵培養，且具有真核細胞翻譯后折疊修飾、加工、糖基化等功能[17-20]。畢赤酵母中醇氧化酶1(alcohol oxidase 1，AOX1)啟動子是一個強啟動子，已經成功誘導表達了數百種外源蛋白[21-24]，因而畢赤酵母是表達牛乳鐵蛋白的優良載體。

為便于分泌表達，本研究以較小分子質量的牛乳鐵蛋白N端功能片段(包括2個功能結構域的1～333氨基酸序列，bovine lactoferrin functional fragment, BlfFf)為重組表達目標，目標基因經密碼子優化后構建重組質粒，使用畢赤酵母GS115分泌表達。并比較了BSM、D’Anjou、RDM[25-26]三種高密度發酵培養基對目的蛋白表達的影響，為畢赤酵母高密度發酵生產牛乳鐵蛋白相關產品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

PichiapastorisGS115菌株為本實驗室保存。質粒pPIC9K-BlfFf由擎科公司合成構建。

1.1.2 引物

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.3 主要試劑

DNA限制性內切酶、DNA marker,TaKaRa公司；遺傳霉素(G418)、質粒抽提試劑盒、酵母基因組提取試劑盒、TMB顯色液,上海生工；分子量蛋白marker、BSA、PVDF膜,索萊寶公司；Anti-6﹡His單克隆抗體、HRP標記的羊抗鼠IgG二抗,浩克生物公司；Anti-6﹡His-tag親和層析柱(His-Trap HP),GE公司;His Tag ELISA Detection Kit試劑盒,南京金斯瑞。

1.1.4 培養基

LB、YPD、MD、BMGY與BMMY配方參照Invitrogen公司的《畢赤酵母表達操作手冊》。

BSM培養基參照PichiaFermentation Guidelines (Version B，053002，Invitrogen)。

D’Anjou(g/L)培養基：(NH4)2SO420，KH2PO412，MgSO44.7，CaCl2·2H2O 0.36，甘油40，PTM1 4.35 ml/L，用5 mol/L的KOH調pH值到5.0。

RDM培養基(g/L)：(NH4)2SO41.65，KH2PO412，MgSO44.7，CaCl2·2H2O 0.36，甘油40，KOH 3.37，谷氨酰胺 1.74，精氨酸 1.46，PTM1 4.35 mL/L，用5 mol/L的KOH調pH值到5.0。

PTM1(g/L)：CuSO4·5H2O 6，NaI 0.08，MnSO4·H2O 3，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02， CoCl20.5，FeSO4·7 H2O 65，生物素 0.2，濃H2SO45 mL。

1.2 方法

1.2.1 重組酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的構建與篩選

提取pPIC9K-BlfFf重組質粒DNA，用Bpu1102 Ⅰ線性化處理，電轉至畢赤酵母GS115，加入1 mL預冷的1 mol/L三梨醇，30 ℃孵育2 h，涂布于MD平板中，30 ℃靜置培養72 h，在平板上加入適量無菌水并用玻璃棒涂布刮菌，菌液用無菌水稀釋至10-5，取50 μL分別涂布于含有0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板篩選抗性轉化子。挑選抗性轉化子接入YPD培養基中,于30 ℃、200 r/min培養24 h，用酵母基因組提取試劑盒提取基因組DNA，以alfa-sig-F、3‘AOX1-R鑒定BlfFf基因是否整合入酵母基因組中。設置空載體酵母重組子GS115-pPIC9K為陰性對照。

1.2.2 重組畢赤酵母的誘導表達

將抗性平板上較大的單菌落接種于BMGY中，30 ℃、200 r/min搖床培養18 h(OD600≈2～6)，離心收集菌體，用適量的BMMY培養基懸浮菌體，接種于BMMY使其初始OD600=1.0，于30 ℃、200 r/min繼續培養96 h，每24 h添加100%甲醇，誘導濃度為0.5%。誘導結束離心取上清，-20 ℃保存備用，實驗設GS115-pPIC9K為陰性對照。

1.2.3 表達產物的鑒定

取1 mL誘導96 h的發酵上清，以甲醇-氯仿法沉淀蛋白，用40 μL去離子水溶解蛋白，加入SDS-Loading Buffer后煮沸10 min，進行SDS-PAGE和Western Blot分析。轉印后的膜用0.5%的BSA封閉1 h，加入Anti-6﹡His單克隆抗體孵育1 h，PBST漂洗3次，10 min/次，再以HRP標記的羊抗鼠IgG二抗孵育1 h，PBST漂洗3次后，用TMB顯色。

1.2.4 重組牛乳鐵蛋白功能片段的純化

將離心后的發酵液上清過0.45 μm膜，再以超濾法除鹽濃縮，分別收集截留液和透過液。以截留上清過鎳柱，帶有His標簽的蛋白可與鎳柱中鎳結合，然后分別以40、100、150、250、500 mmol/L咪唑洗脫，收集洗脫峰與流穿液。以10 000 Da超濾管超濾，置換緩沖液，進行SDS-PAGE和Western Blot檢測。

1.2.5 重組牛乳鐵蛋白功能片段的質譜鑒定

純化后的目的蛋白經Western Blot鑒定后，將對應的SDS-PAGE上目的條帶切膠后進行LC-MS鑒定(蘇州普泰生物醫藥有限公司檢測)。

1.2.6 重組酵母表達上清目的蛋白的ELISA定量檢測

按照南京金斯瑞公司His Tag ELISA Detection Kit試劑盒說明書操作。

1.2.7 三種高密度發酵培養基的生產比較

挑選搖瓶表達量最大的菌株用于高密度發酵，以10%接種量分別接入含3 L BSM、RDM、D’Anjou培養基的5 L發酵罐，用氨水、KOH、H3PO4調pH值至5.0，溫度為30 ℃，調節轉速與通氣量，控制溶氧在20%以上。當培養基中甘油消耗完后，溶氧(dissolved oxygen, DO)快速上升(DO>60%)，隨即開始流加含有PTM1的質量濃度為500 g/L的甘油200 mL，流速50 mL/h。流加結束后饑餓30 min，流加含有PTM1的100%甲醇進行誘導，控制比生長速率在0.015 h-1左右，調節轉速與通氣量，控制溶氧大于20%，誘導后每12 h分別取樣，測定目的蛋白含量與菌體濕重。

2 結果與討論

2.1 GS115-pPIC9K-BlfFf重組菌的構建與篩選

M-DNA marker 2k plus；2-對照(GS115-pPIC9K)；1、3～12-重組轉化子中BlfFf的PCR產物圖1 重組酵母菌的PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant yeast by PCR

將合成的重組質粒pPIC9K-BlfFf電轉化入P.pastorisGS115，通過組氨酸營養型與G418抗性篩選，得到重組酵母GS115-pPIC9K-BlfFf。GS115-pPIC9K-BlfFf中BlfFf的PCR結果顯示(圖1)含有1 200 bp的目的基因擴增條帶，對照GS115-pPIC9K無擴增條帶，測序結果與目的基因序列相同。結果表明表達牛乳鐵蛋白功能片段的重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-BlfFf構建成功。

2.2 表達產物的鑒定

2.2.1 SDS-PAGE分析

挑選表達量較高的克隆進行發酵。發酵上清的SDS-PAGE分析顯示，與GS115-pPIC9K菌株相比，重組酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的發酵上清可見分子質量約為37 kDa的蛋白條帶(圖2)。

M-蛋白分子量marker；1～8-高抗性轉化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1～8的發酵上清；9-GS115-pPIC9K的發酵上清圖2 轉化子發酵上清的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE profile of expression products

2.2.2 搖瓶發酵上清的Western Blot分析

Western Blot檢測結果顯示，重組酵母菌GS115-pPIC9K-BlfFf的搖瓶發酵上清與Anti-6﹡His單克隆抗體可發生特異性反應，在37 kDa處有特異性條帶可見，與SDS-PAGE結果一致，見圖3。

M-蛋白分子量marker；1～8-高抗性轉化子GS115-pPIC9K-BlfFf-1～8的發酵上清；9-GS115-pPIC9K的發酵上清圖3 搖瓶發酵上清的Western Blot分析Fig.3 Western Blot analysis for the fermentation supernatant in shake flask

結果表明，構建的GS115-pPIC9K-BlfFf, 75%轉化子成功分泌表達牛乳鐵蛋白功能片段，4#、5#轉化子發酵上清未發生特異性反應，為假陽性。蛋白灰度掃描結果表明3#菌表達能力最強(圖3)，選取該菌株用于高密度發酵試驗。

2.3 重組牛乳鐵蛋白功能片段的純化與質譜鑒定

以鎳鰲合親和層析柱對表達的牛乳鐵蛋白功能片段進行純化，在40、100、150 mmol/L咪唑濃度下分別得到洗脫峰(圖4)。經SDS-PAGE檢測，150 mmol/L咪唑下的洗脫峰樣品在37 kDa處出現單一條帶(圖5)。100 mmol/L咪唑下無蛋白，可能是核酸等雜質污染導致起峰。Western Blot鑒定結果顯示，150 mmol/L咪唑濃度下的洗脫峰樣品在37 kDa處顯色，出現特異性條帶，且顯色最深，為主要的蛋白洗脫峰；40 mmol/L咪唑濃度下的洗脫峰樣品也出現分子量符合的特異性條帶，說明目的蛋白組分與鎳柱結合能力存在差異；流穿液樣品中含有少量目的蛋白，說明有部分蛋白沒有結合(圖6)。實驗表明，親和層析可以較有效地純化牛乳鐵蛋白功能片段。

圖4 發酵上清鎳柱親和層析過程圖Fig.4 Time course of nickel affinity chromatographic purification with fermentation supernatant

M-蛋白分子量marker；1-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K甲醇誘導發酵上清；2-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇誘導發酵上清；3-40 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；4-100 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；5-150 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；6-鎳柱流穿液濃縮脫鹽上清圖5 純化樣品的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of purification samples

純化后的目的產物經LC-MS鑒定，確定分子量和氨基酸序列與預計相符，表明該蛋白得到正確表達。

2.4 三種高密度發酵培養基的生產比較

M-蛋白分子量marker；1-鎳柱流穿濃縮脫鹽上清；2-100 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；3-150 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；4-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K-BlfFf-3甲醇誘導發酵上清；5-40 mmol/L咪唑洗脫濃縮脫鹽上清；6-菌株P. pastoris GS115-pPIC9K甲醇誘導發酵上清圖6 純化產物的Western Blot分析Fig.6 Western Blot analysis for the purification products

BSM、RDM、D’Anjou三種培養基是畢赤酵母高密度發酵中使用較多的培養基配方。取GS115-pPIC9K-BlfFf-3菌株，分別使用BSM、RDM、D’Anjou 3種培養基進行高密度發酵以表達牛乳鐵蛋白功能片段。經甲醇誘導48 h(發酵72 h)后，菌體濕重在3種培養基中分別達到350、297、233 g/L(圖7-A)。

A-BSM、D’Anjou、RDM三種培養基的菌體生長曲線；B-BlfFf在BSM、D’Anjou、RDM培養基的誘導表達時間過程； C-表達產物的Western Blot分析(M-Marker; 1-D’Anjou發酵樣品; 2-RDM發酵樣品; 3-BSM發酵樣品)圖7 BlfFf在3種不同高密度培養基中的生產比較Fig.7 Comparison of BlfFf production in high-cell-density fermentation with three different media

在甲醇誘導階段，菌體生長速度較慢， BSM、RDM、D’Anjou培養基中酵母平均比生長速率分別為0.016 h-1、0.012 h-1、0.008 h-1。隨著誘導時間的增加，目的蛋白的產量逐漸增加。在甲醇誘導24 h后，目的蛋白表達量增長明顯。誘導48 h后，RDM、BSM培養基中產量相差不大，分別為38.1、29.5 mg/L，D’Anjou培養基中表達量為20.3 mg/L(圖7-B)。綜合比較，選擇RDM作為高密度發酵培養基。由于RDM鹽濃度較低，使用該培養基既可以減少培養基成本，又可以減少分離純化過程中的脫鹽步驟且使后期處理更加便利。誘導結束后的發酵液經Western Blot分析，確認目的蛋白得到表達(圖7-C)。

3 結論

以牛乳鐵蛋白N端功能片段(1～333氨基酸序列)為重組表達目標，經密碼子優化基因序列后，連接至表達載體pPIC9K，構建重組表達載體pPIC9K-BlfFf并轉化畢赤酵母GS115篩選得到3#高表達菌株；表達產物經鎳柱親和層析純化，在150 mmol/L咪唑濃度下洗脫得到37 kDa目標條帶，Western Blot和質譜鑒定表明純化得到了正確表達的牛乳鐵蛋白功能片段。3#菌株分別用3種培養基進行高密度發酵，結果表明RDM培養基最優，甲醇誘導48 h，目的蛋白表達量為38.1 mg/L。與傳統的BSM培養基比較，采用RDM培養基降低了培養基成本及分離純化過程中的脫鹽成本，為該產品工業放大生產提供了依據。