耐久腸球菌C11菌株的環境脅迫耐受性及其低溫適應相關基因的基因組學鑒定

姚文婷，陳蘭明*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海)，上海，201306)

國內外大量研究表明，乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)具有調節宿主腸道微生態平衡、降低膽固醇、調節免疫功能及延緩衰老等生理功能[1]。耐久腸球菌(Enterococcusdurans)隸屬于硬桿菌門(Firmicutes)，桿菌綱(Bacilli)，乳酸桿菌目(Lactobacillales)，腸球菌科(Enterococcaceae)，腸球菌屬(Enterococcus)。該菌是動物腸道微生物的重要組分，且常見于發酵食品，如酸奶和奶酪中[2]。不同來源的耐久腸球菌的生物學特性和生理功能各不相同[3-4]。例如，黃堅等[5]從牦牛發酵酸奶中篩選到耐久腸球菌SWUN5857菌株，發現該菌株能夠適應小鼠胃腸環境，有效提高小鼠體質量，促進小鼠胸腺和脾臟發育，增強小鼠免疫功能。LIU等[6]從內蒙古天然發酵奶油中分離到耐久腸球菌KLDS6.0930菌株，該菌則具有耐膽鹽，吸收膽固醇等作用。

耐低溫LAB不僅能夠有效抑制腐敗菌在低溫下的生長和繁殖，而且，在食品發酵過程中因其低溫適應性，有助于降低生產能耗，節約企業成本。因此，耐低溫LAB的篩選對于食品加工與貯藏具有重要意義。然而，大多數LAB屬于中溫型微生物，一般最適生長溫度為30～40 ℃；在低于10 ℃的溫度下，LAB生長微弱，甚至不生長[7]。迄今為止，國內外有關嗜冷LAB的研究已有報道。例如，LI等[8]報道了3株在15 ℃生長的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) LZ95、CY2和CY3菌株，其中，LZ95菌株在de Man-Rogosa-Sharpe(MRS)培養基中培養48 h后，OD620nm值增加了10倍。LI等[9]從藏牦牛瘤胃中分離到具有纖維素分解能力的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) JF85和Y83菌株，發現它們能夠在15 ～55 ℃的溫度下生長。

本研究基于前期研究基礎，聚焦于1株分離自中國傳統發酵食品且具有良好的體外抗氧化性的耐久腸球菌C11菌株(E.duransC11)[10]，分析該菌株在不同環境脅迫條件下的耐受性，并運用比較基因組學方法探討E.durans的低溫適應機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

耐久腸球菌C11菌株分離自我國傳統發酵食品——乳餅[10]，由本實驗室篩選、鑒定并保藏。

1.1.2 培養基、主要試劑及儀器

MRS培養基，北京陸橋技術有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS) (pH 7.4)、λ/HindIII DNA Marker (MD202)、6×Loading buffer，天根生化科技有限公司；Takara MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒，上海皓嘉科技發展有限公司；膽鹽和瓊脂，國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶(活性1∶3 000)、胰酶(活性1∶250)、微孔過濾膜(0.22 μm)、NaCl，上海生工生物工程有限公司；多功能酶標儀，BioTek公司；雷磁pHS-3C pH儀，上海雷磁儀器廠；Research?plus pipette移液器、臺式高速低溫冷凍離心機5417R、高速冷凍離心機5424、PCR儀，Eppendorf公司；凝膠成像系統Molecular Imager?Gel DocTMXR+ System，Bio-Rad公司；全自動生長曲線分析儀，Bioscreen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1E.duransC11菌株的培養

參考XU等[10]的方法，E.duransC11菌株以體積分數1%接種于MRS液體培養基中，置于37 ℃厭氧培養至對數生長期，連續傳代培養2代，得到新鮮培養物。4 000 r/min離心10 min，用無菌PBS洗滌菌體3次(避免帶入接種物中的酸性物質從而改變pH)。用適量的PBS懸浮菌體沉淀作為種子液備用。

1.2.2 溫度、酸、滲透壓的耐受性分析

按照1%體積分數的接種量將新鮮種子液接種到MRS液體培養基中，在不同溫度(10、15、20、25、37、45 ℃)培養72 h，采用全自動生長曲線分析儀實時檢測培養物在600 nm波長處的吸光度值(OD600 nm)，3次重復。

按照1%體積分數的接種量將新鮮種子液分別接種到不同起始pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、不同NaCl質量分數(0、5.0%、8.0%、10.0%、12.0%、15.0%)、以及不同膽鹽質量分數(0、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%)的MRS液體培養基中，于37 ℃培養24 h，實時檢測培養物的OD600 nm值，3次重復。

1.2.3 人工胃液及腸液的耐受性分析

參照ZHANG等[11]的方法制備人工模擬胃液(pH 2.0)和人工模擬腸液(pH 6.8)。按照10%體積分數將新鮮種子液分別接種于經膜過濾除菌的1.0 mL人工胃液和人工腸液中，充分混勻，分別于37 ℃孵育180 min和240 min后取樣，10倍梯度稀釋，以標準平板法計數，計算細菌的存活率，實驗3次重復。

1.2.4 細菌基因組DNA的制備

采用Takara MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書步驟提取E.duransC11菌株的基因組DNA。采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品，凝膠成像系統拍照記錄實驗結果，多功能酶標儀測定DNA樣品的濃度和純度(A260/A280)。

1.2.5 基因組DNA序列的測定、質控和裝配

運用Illumina HiSeq Xten測序平臺，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司測定E.duransC11全基因組序列。采用FASTQC軟件[12]分析原始序列reads的質量。采用SOAP denovo軟件(version 2.04)(http://soap.genomics.org.cn/)進行序列裝配。

1.2.6 基因組注釋

采用Glimmer (Version 3.0)[13]、tRNA_scan-SE (Version 1.3.1)[14]、RNAmmer (Version 1.2)軟件[15]分別預測編碼基因、tRNA、rRNA基因。采用Prophage Finder預測噬菌體序列(http://phast.wishartlab.com/)。采用CRISPRFinder軟件[16]預測CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)位點。采用PGAP[17]、CD-Search[18]、SignalP 4.1 Serve[19]、TMHMM[20]軟件分別預測假基因、Pfam域的基因、信號肽、跨膜結構域。通過比對毒力因子數據庫VFDB(virulence factors database) (http://www.mgc.ac.cn/VFs/)、耐藥基因數據庫ARDB (antibiotic resistance genes database) (http://arpcard.mcmaster.ca) 分別預測毒力、耐藥基因(Identity>70%, E<1e-10)。

1.2.7 比較基因組分析

截止到2018年12月20日，從美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)基因組數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)中檢索到17株E.durans菌株的基因組序列，其中3株菌為全基因組序列，14株菌為基因組草圖，及E.duransC11共18株耐久腸球菌用于比較基因組分析(表1)。采用BLAST(basic local alignment search tool)軟件比對分析菌株特異基因(閾值e-10)。采用CD-HIT[21]、Muscle軟件[22]分析同源基因并對其進行多序列比對。采用PhyML軟件[23]以鄰接算法構建系統發育樹，并且進行1 000次bootstrap校驗，使用Evolview軟件繪制系統發育樹[24]。

2 結果與討論

2.1 不同溫度對E. durans C11菌株生長的影響

本研究測定了E.duransC11菌株在不同溫度下(10～45 ℃)的生長曲線，結果如圖1所示。在45 ℃高溫條件下，E.duransC11在MRS培養基(pH 6.8)中幾乎不能生長；與最適生長溫度(37 ℃)相比，在25 ℃條件下，E.duransC11仍生長較快，約6 h進入對數期，21 h達到對數生長中期，30 h到達穩定期；在20 ℃和15 ℃條件下，該菌株約6 h進入對數期，27 h到達對數生長中期，42 h到達穩定期；在10 ℃條件下，菌株生長緩慢，約12 h進入對數期，40 h到達對數生長中期，54 h到達穩定期。上述結果表明，E.duransC11菌株在MRS培養基中能夠適應10～25 ℃的低溫條件。

注：“-”未知。

圖1 溫度對耐久腸球菌C11菌株生長的影響Fig.1 The effect of temperatures on the growth ofE. durans C11

2.2 不同起始pH值對E. durans C11菌株生長的影響

如圖2所示，當MRS培養基的pH為2.0～4.0時，E.duransC11菌株生長緩慢甚至不生長，其OD600nm值無明顯改變。當pH為5.0～6.0時，E.duransC11菌株能夠生長，但與最適生長pH (6.8～7.0)相比，酸性培養條件(pH 5.0～6.0)顯著抑制了E.duransC11的生長。

圖2 不同起始pH值對耐久腸球菌C11生長的影響Fig.2 The effect of different initial pH on the growth ofE. durans C11

2.3 E. durans C11菌株對NaCl的耐受性

與沒有添加NaCl的MRS培養基相比，添加5.0%的NaCl顯著抑制了E.duransC11菌株的生長，約6 h進入對數期，16 h到達對數中期，24 h到達穩定期；當MRS培養基中添加的NaCl質量分數大于8.0%時(8.0%～15.0%)，E.duransC11菌株幾乎不能生長(圖3)。

圖3 耐久腸球菌C11對不同質量分數NaCl的耐受性Fig.3 Tolerance of E. durans C11 to different concentrations of NaCl

2.4 E. durans C11菌株對膽鹽的耐受性

如圖4所示，當膽鹽質量分數大于0.05%時，E.duransC11菌株不能生長，表明該菌株對膽鹽(0.05%～0.3%)無耐受性。

圖4 耐久腸球菌C11對不同質量分數膽鹽的耐受性Fig.4 Tolerance of E. durans C11 to different concentrations of bile salt

2.5 E. durans C11菌株對人工胃腸液的耐受性

E.duransC11菌株對人工胃液(pH 2.0)、人工腸液(pH 6.8)的耐受性如表2所示。在人工胃液中處理180 min后，E.duransC11菌株的存活率為52.5%；而在人工腸液中處理240 min后，E.duransC11的存活率為85.1%，表明E.duransC11菌株對人工腸液的耐受性較強。

表2 耐久腸球菌C11對人工胃液及腸液的耐受性Table 2 Tolerance of E. durans C11 to artificialgastric and intestinal fluids

2.6 E. durans C11基因組草圖特征

運用Illumina Hiseq二代測序技術，本研究測定獲得了E.duransC11的全基因組草圖，共獲得3 126 666條reads，序列全長為2 988 204 bp，GC含量為37.68%。序列裝配得到111個Scaffolds，測序深度為151×。通過基因組序列分析，預測到2 986 個基因，包括2 715個蛋白編碼基因，77個RNA基因，194個假基因。E.duransC11基因組中比對到Pfam域、信號肽、跨膜螺旋結構的基因分別有2 278、137、713個。另外，鑒定到3個CRISPR重復序列，其中包含1個未知的CRISPR序列，位于scaffold 18的16 679～16 757 bp之間，長度為24 bp；2個已知的CRISPR序列，分別位于scaffold 30 的 3 942～4 175 bp和scaffold 53的16 419 ～16 618 bp之間，長度分別為24、36 bp，分別編碼假設蛋白和復制蛋白(replication protein, RepA)。還鑒定到1個完整的原噬菌體基因簇，位于scaffold 3的580～16 832 bp之間，序列全長為16.2 kb，共編碼25個蛋白，其中20個編碼原噬菌體相關蛋白，5個編碼假設蛋白(表3)。

表3 E. durans C11基因組測序數據Table 3 E. durans C11 genome statistics

注：“-”:未知

E.duransC11基因組中還鑒定到2個耐藥基因(tetm、baca)，分別與四環素(tetracycline)、桿菌肽(bacitracin)抗性相關。此外，還發現了17個編碼黏附素、產胞外酶、膜表面蛋白、莢膜多糖等相關基因(efaA、eno、gapA、tuf、bsh、GroEL、bopD、srt2/srt1/bee1/bee3、pilF、pilB、hasC)，可能與耐久腸球菌對宿主細胞的黏附、定殖、侵染等相關[27]。

2.7 比較基因組分析

2.7.1E.duransC11基因組預測蛋白質編碼基因的COG功能分類

比較基因組分析揭示了18株E.durans菌株的基因組中48 112個蛋白質編碼基因，它們在C11菌株基因組中的COG功能分類如表4所示。

表4 E. durans C11基因組預測蛋白質編碼基因的COG功能分類Table 4 The number of genes classified into the 24 COGfunctional categories in E. durans C11 genome

續表4

分類E. durans C11基因個數占比/%功能描述F752.76核苷酸轉運與代謝S54920.22未知功能P1224.49無機鹽離子轉運與代謝U230.85細胞內運輸、分泌、小泡運輸I481.77脂質轉運與代謝R00.00胞外結構O622.28翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶蛋白L2489.13復制、重組和修復A10.04RNA加工和修飾B00.00染色質結構和動力學Q210.77次級代謝產物的生物合成、轉運、分解代謝T612.25信號轉導機制K1846.78轉錄J1545.67翻譯、核糖體結構和生物合成Y00.00核結構-1 21017.61未匹配到數據庫

E.duransC11基因組中約2 237個蛋白質編碼基因比對到COG數據庫，分屬24個功能分類(表4)。其中，編碼未知功能(S)，復制、重組和修復(L)，碳水化合物轉運與代謝(G)，轉錄(K)，翻譯、核糖體結構與生物合成(J)基因的占比位居前5位，分別占所有蛋白編碼基因的20.22%、9.13%、7.40%、6.78%、5.67%。

2.7.2E.durans基因組系統發育樹

基于18株E.durans基因組的同源基因構建了系統發育樹(圖5)。由圖5可見，18株E.durans的基因組聚為3簇，分別為cluster α、 β、γ。其中，cluster γ又聚為2個亞類，分別為Subcluster I和Subcluster II。在Subcluster II中，E.duransC11與E.duransNCTC8130、E.durans18S菌株具有相近的系統發育關系，其中，E.durans18S分離自奶酪，而E.duransNCTC8130的來源未知，它們的生物學特性均未有報道。

圖5 18株耐久腸球菌基因組的系統發育樹Fig.5 A phylogenetic tree of the 18 E. durans genomes

2.7.3E.duransC11菌株的特異基因

比較基因組分析揭示了E.duransC11基因組中33個菌株特異基因，其中，26個編碼假設蛋白，7個分別編碼螺旋轉角螺旋域蛋白(helix-turn-helix domain-containing protein) (EIA52_00535)、環內酯自誘導肽(cyclic lactone autoinducer peptide) (EIA52_00555)、I型限制性內切酶R亞基(type I restriction endonuclease subunit R) (EIA52_06120)、DUF3037域結合蛋白(DUF3037 domain-containing protein) (EIA52_12720)、切除酶(excisionase) (EIA52_13810)、CPBP家族膜內金屬蛋白酶(CPBP family intramembrane metalloprotease) (EIA52_13980, EIA52_13990)，它們與E.duransC11的低溫適應性關系機制有待進一步的研究。

2.8 E. durans C11可能的低溫適應機制

2.8.1 調節細胞膜脂組成

當環境溫度下降時細胞膜的流動性降低，細胞難以發揮正常生理功能。然而，耐低溫菌通過改變膜脂組成，如提高不飽和脂肪酸比例來調節細胞膜的流動性[28]。在大腸桿菌(Escherichiacoli)中，參與不飽和脂肪酸合成的2個關鍵酶為3-羥基癸脂酰ACP脫水異構酶(3-hydroxydecanoyl-ACP dehydratase/isomerase, FabA)和3-酮脂酰ACP合成酶 I(3-Ketoacyl-ACP synthase I, FabB)[29]。研究發現，革蘭氏陽性菌糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)基因組中含有fabZ1 (EIA52_09905)和fabF1 (EIA52_10800)基因，分別與大腸桿菌fabA和fabB序列高度同源[30]。在本研究中，從E.duransC11基因組中鑒定到fabZ1和fabF1基因，它們與E.faecalis中的fabZ1和fabF1有較高的氨基酸序列同源性(97%, 91%)，推測E.duransC11可能通過FabZ1-FabF1途徑合成不飽和脂肪酸，以增加細胞膜的流動性，減少低溫對細胞的損傷。

2.8.2 增加細胞內相容性溶質(compatible solutes)

據文獻報道，相容性溶質(如甘氨酸、甜菜堿、甘油、海藻糖、甘露醇和山梨醇等)能夠在細胞質內積累到很高濃度，并保護細胞免受低溫、高溫、干燥等應激損害[31]。在本研究中，通過比較基因組分析，在E.duransC11基因組中鑒定到編碼甘氨酸/甜菜堿/膽堿轉運(glycine betaine/carnitine transport)的基因簇(OpuABCD) (EIA52_01405, EIA52_12825, EIA52_12830, EIA52_12835, EIA52_12840)。研究發現，在15 ℃培養條件下，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)利用甜菜堿轉運蛋白OpuA、OpuC和OpuD將甜菜堿攝入細胞，或利用前體膽堿合成甜菜堿，從而保護細胞免受低溫損傷[32]。

2.8.3 改變蛋白質的氨基酸組成

KREIL等[33]研究發現，當溫度降低時，蛋白質中谷氨酰胺(Gln)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、組氨酸(His)的含量增加。另外，嗜冷酶通過疏水性脯氨酸(Pro)含量的減少來提高酶的柔韌性[34]，使酶的活性中心更容易與底物接近，使之在低耗能時發揮作用。本研究中E.duransC11在低溫條件下表達蛋白質中Gln、Ser、Thr、His和Pro的含量變化情況有待蛋白質組學的進一步研究。

2.8.4 冷激蛋白和熱激蛋白

冷激蛋白(cold shock proteins, Csps)參與細胞內多種代謝途徑，如轉錄、翻譯、蛋白質折疊，以及細胞膜流動性的調控等[35]。熱激蛋白(heat shock proteins, Hsps)不僅在細菌的熱應激,而且在冷應激中也發揮作用,原因在于許多Hsps是分子伴侶，在低溫及其他應激條件下同樣被誘導表達[36]。研究發現，當溫度發生變化時，分子伴侶可以在原位調控蛋白質暴露的活性區域之間的相互作用，使蛋白折疊成為正確的構象[37]。在本研究中，比較基因組分析揭示了E.duransC11基因組4個分子伴侶：GrpE (EIA52_03480)、DnaJ (EIA52_03490)、DnaK (EIA52_03485)、hslO (EIA52_12115)；2個Hsps (EIA52_03735, EIA52_12085)；1個Hsps轉錄調節因子hrcA (EIA52_03475)；6個Csps (EIA52_03155, EIA52_04230, EIA52_04370, EIA52_09445, EIA52_13120, EIA52_11270)。此外，在E.duransC11基因組中還鑒定到1個DEAD-box ATP-dependent RNA解旋酶編碼基因(CshB，EIA52_09480)，與DEAD-box RNA解旋酶CsdA(Psyc_1082)氨基酸序列同源性為32%。當溫度下降時，CsdA促進mRNA的解旋，調控微生物基因表達[38]。

2.8.5 應激相關調節子

轉錄組學研究發現，在低溫條件下，副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus) CHN25的應激相關調節子編碼基因表達上調，例如LysR、GntR、MerR家族轉錄調節子、3’-5’-環磷酸腺苷(cAMP)受體蛋白(CRP)。在本研究中，在E.duransC11基因組中鑒定到CRP(EIA52_03380, EIA52_06660, EIA52_08790, EIA52_13485)、LYSR(EIA52_00465, EIA52_09350, EIA52_09710, EIA52_12995)、GntR(EIA52_00775, EIA52_00995, EIA52_03005, EIA52_04360, EIA52_05535, EIA52_11320)、MerR(EIA52_02670, EIA52_03215, EIA52_03870) 家族轉錄調節子等編碼基因[39]。CRP是一種參與糖代謝的調節因子，在大腸桿菌的冷適應中發揮重要作用。據研究報道，細菌對于零下溫度的適應涵蓋了能量的合成、翻譯、運輸等方面[40]。例如，低溫嗜冷桿菌(Psychrobactercryohalolentis) K5菌株能夠在-4 ℃下誘導一些重要調控子的表達，如調節能量需求的F1/F0 ATP合成酶，在低溫下排除有害物質的外膜外排系統蛋白(TolC)，加快翻譯過程的延伸因子Ts(EF-Ts)等，這些基因在E.duransC11基因組中均被鑒定到(EIA52_00860, EIA52_06915, EIA52_06625)，可能與其低溫適應性相關。

3 結論

本研究發現耐久腸球菌C11菌株能夠在15～25 ℃溫度條件下生長。該菌株的基因組草圖已被測定，全長2 988 204 bp，GC含量37.68%，GenBank序列登錄號為RQWF00000000。比較基因組學分析揭示了E.duransC11的33個菌株特異性基因，以及大量參與細胞膜脂組成、相容性溶質吸收或合成、環境脅迫應激調控等相關基因，可能與其低溫適應相關。轉錄組學和蛋白質組學的進一步分析將有助于闡釋耐久腸球菌低溫適應的分子調控網絡。