赤擬谷盜來源天冬氨酸α-脫羧酶分子改造及催化合成β-丙氨酸工藝的建立

王超，葉文琪，薛嵐，劉中美，周哲敏

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

β-丙氨酸是自然界中存在的唯一一種β型氨基酸，廣泛應用于醫藥、食品及化工等領域[1]。醫藥領域用于合成肌肽、巴柳氮、帕米磷酸鈉等[1]；在食品領域作為食品和飼料添加劑[1]；在化工領域用作電鍍緩蝕劑等[1]。β-丙氨酸的合成方法有化學合成法和生物合成法，化學合成法是目前生產β-丙氨酸的主要方法[1-2]，但是存在工藝條件苛刻、耗能高及環境不友好等缺點[3]；生物合成法是以L-天冬氨酸為底物，利用細胞內L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartate α-decarboxylase，EC4.1.1.11panD)，催化生成β-丙氨酸[4]，生物合成法由于反應條件溫和、操作簡便受到廣泛的關注。高麗娟等擴增了E.coliDH5a的panD基因，在E.coliBL21(DE3)中進行表達和誘導條件優化，經0.4 mmol/L IPTG和10 g/L的乳糖誘導后，最終發酵液中β-丙氨酸的質量濃度為2.5 g/L和4.7 g/L[5]；SHEN等對谷氨酸棒桿菌來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶進行研究，采用純酶催化，36 h可產生12.85 g/L的β-丙氨酸[4]；SONG等利用E.coliW3110異源擴增谷氨酸棒桿菌的panD基因，構建從葡萄糖開始到β-丙氨酸合成途徑，發酵39 h β-丙氨酸產量達到32.3 g/L[6]。這些研究在生物合成法生產β-丙氨酸方面取得了一定進展，但是依然存在酶活低、產物濃度不高、轉化時間長等缺點，距工業應用尚有一段距離。

目前研究較多的L-天冬氨酸α-脫羧酶主要來源于原核生物，例如大腸桿菌[7](Escherichiacoli)、幽門螺桿菌[8](Helicobacterpylori)、結核分歧桿菌[9](Mycobacteriumtuberculosis)、谷氨酸棒桿菌[10](Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢桿菌[11](Bacillussubtilis)等。1979年，JONAAE等對大腸桿菌來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶進行研究，測得其最適反應溫度為55 ℃，溫度穩定性較好，在26～78 ℃維持50%以上酶活[7]；2010 年，石增秀等克隆并表達了谷氨酸棒桿菌來源的panD基因，測得其最適反應溫度為55 ℃，80 ℃下的半衰期為40 min[12]；2015年，鄧思穎等克隆表達了枯草芽孢桿菌來源的panD基因，測得其最適反應溫度為60 ℃，65 ℃溫育12 h，殘余酶活為73%[11]；2017年，陳夏林等克隆并表達了杰氏棒桿菌來源的panD基因，研究其酶學性質發現該酶在30～50 ℃下較穩定，在60 ℃溫育12 h，殘余酶活約為60%[13]。原核來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶是一類丙酮酰基依賴型酶[14]，需要在體內經過剪切形成有活性的酶[10，15]，其穩定性較好但酶活普遍偏低[16]，因此生物催化法生產β-丙氨酸的產量也處于較低水平。有研究表明，在昆蟲體內也存在L-天冬氨酸α-脫羧酶[17-20]，其催化產生的β-丙氨酸對昆蟲幼蟲色素沉淀等有重要影響[21]，與原核來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶相比，真核來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶是磷酸吡哆醛(PLP)依賴型的酶[22]。2010年，GRAHAM克隆并表達了蚊子來源的panD基因，并對其底物特異性進行研究[23]；2015年IRINA等將鞘翅目昆蟲赤擬谷盜、原核生物大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌3種來源的panD基因分別整合到釀酒酵母基因組中，進行代謝研究，發現真核生物來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶對終產物產量的提高起到了重要作用[24]。因此，我們推測赤擬谷盜來源L-天冬氨酸α-脫羧酶酶活較高，具有一定的應用前景。

前期研究中，在大腸桿菌中重組表達了來源于真核生物赤擬谷盜的L-天冬氨酸α-脫羧酶(TcADC)[16]，酶學性質表征結果顯示，其比酶活為谷氨酸棒桿菌來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶的2倍，但其熱穩定性較差[16]。本研究針對其穩定性差的問題，通過定點突變進行分子改造，提高其熱穩定性，同時建立全細胞催化生產β-丙氨酸工藝，為β-丙氨酸工業生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

重組大腸桿菌BL21/pET28a-TcADC為實驗室前期構建，重組菌株種子培養基為LB培養基，誘導培養基為2YT培養基。

L-天冬氨酸鈉、β-丙氨酸、IPTG、卡那霉素：上海生工生物工程有限公司；引物由蘇州金維智公司合成；酵母提取物、蛋白胨：Oxford公司；PITC：Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 突變體位點的選擇及引物設計

以人類來源半胱氨酸亞磺酸脫羧酶(HuCSADC，PDB ID：2jis)為模板，利用SWISS MODLE在線軟件對TcADC同源建模，并上傳至GETAREA網站，進行表面氨基酸預測，選取TcADC分子表面所有Lys和Gly分別突變成Arg和Ala，以重組質粒pET28a-TcADC為模板，使用Primer 5.0 軟件設計引物(表1)。

1.2.2 突變體構建、表達與純化

以重組質粒pET28a-TcADC為模板，利用全質粒PCR方法引入定點突變，構建突變體，DpnⅠ消化PCR模板后，將構建的質粒轉化進E.coliJM109，抗性平板篩選陽性克隆，將DNA測序正確質粒轉化E.coliBL21(DE3)，以備表達。

表1 本文所用引物及序列Table 1 Primers used in this study

注：下劃線表示突變位點處替換的密碼子。

將重組大腸桿菌BL21/pET28a-TcADC接種于5 mL卡那霉素質量濃度為50 μg/mL的LB培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養8～12 h，將上述培養物按1%接種量接種于卡那霉素質量濃度為50 μg/mL的2YT培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養至OD600為0.6～0.8，加入終濃度0.2 mmol/L IPTG，20 ℃培養20 h，收集菌體進行超聲破碎，通過SDS-PAGE方法鑒定蛋白表達水平。收集菌體溶于結合緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)，超聲破碎，4 ℃ 12 000 r/min離心，上清用0.22 μm濾膜過濾，用5倍柱體積結合緩沖液平衡His Trap HF柱，取10 mL的破碎上清上樣，用5倍柱體積結合緩沖液洗去非特異性結合的蛋白，用15倍柱體積洗脫緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑)線性洗脫蛋白。收集樣品，用透析袋密封，置于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中，4 ℃過夜透析，除去殘余的咪唑，SDS-PAGE分析鑒定。蛋白質定量采用Bradford法[25]。

1.2.3L-天冬氨酸和β-丙氨酸測定

反應液采用異硫氰酸苯酯(PITC)衍生，具體步驟：取500 μL反應溶液于2 mL離心管，加入250 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液，充分混合均勻，避光室溫衍生1 h后，加入750 μL己烷，渦旋振蕩器振蕩20 s，靜置分層，吸取下層850 μL溶液，0.22 μm有機濾膜過濾。

衍生產物采用HPLC測定，色譜柱為La Chrom C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A：體積分數80%的乙腈水溶液，B溶液：體積比97∶3(pH 6.5)的0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈溶液；梯度洗脫：0～20 min，B溶液由95%下降至65%；20～30 min，B溶液由65%上升至95%；30～43 min，B溶液梯度保持不變，檢測波長254 nm，柱溫40 ℃。

1.2.4 酶學性質測定

取適量酶液于1.5 mL離心管中，加入終濃度為100 mmol/L的L-天冬氨酸鈉，PLP終濃度1 mmol/L，于37 ℃，pH 6.5條件下反應30 min，檢測酶活。

酶活定義：在37 ℃，pH 6.5的條件下，每小時轉化L-天冬氨酸鈉生成1 mmol β-丙氨酸所需酶量為1個酶活力單位U。

比酶活定義：每克蛋白所含的酶活單位數。

最適反應溫度測定：取適量純酶液于1.5 mL離心管中，加入終濃度100 mmol/LL-天冬氨酸鈉，PLP終濃度1 mmol/L，分別于30、37、40、42、50、55 ℃ pH 6.5條件下反應30 min測定酶活，將最高的酶活定義為100%。

最適反應pH測定：取適量純酶液于1.5 mL離心管中，分別加入相同體積的pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0的緩沖溶液，然后分別于37 ℃反應30 min測定酶活性，將最高的酶活定義為100%，分析酶活隨pH的變化情況。

熱穩定性測定：取適量純酶液置于0、20、30、40、50、60 ℃金屬浴中處理30 min后，于冰上冷卻5 min，在37 ℃，pH 6.5條件下反應30 min測定酶活性，將所測得最高酶活定義為100%，分析酶的熱穩定性。

pH穩定性測定：取適量純酶液，加入相同體積的pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0 的緩沖溶液調整酶液pH，于冰上放置8 h，然后在37 ℃ pH 6.5條件下反應30 min測定酶活性，將所測最高的酶活定義為100%，分析酶的pH穩定性。

1.2.5 全細胞催化生成β-丙氨酸

將0.4 mol/L的固體底物L-天冬氨酸鈉分批添加到10 mL，OD600為200的菌液中并不斷攪拌，反應溫度維持在37 ℃左右，每隔4 h加入0.4 mol/L固體底物，檢測產物的生成量和底物積累量。

2 結果與分析

2.1 突變體篩選

早在1980年，ARGOS等對嗜熱蛋白的氨基酸組成進行了分析，發現嗜熱蛋白氨基酸序列中有Gly替換為Ala以及Lys替換為Arg的趨勢[26]；ZHANG等在T4溶菌酶中插入了單個或多個Ala突變，有效提高了該酶的熱穩定性[27]；MRABET等利用將Lys突變成Arg的策略提高了木聚糖異構酶的熱穩定性[28]；葉雙雙等采用Lys突變成Arg，Gly突變成Ala的策略提高苯丙氨酸羥化酶的熱穩定性[29]。然而，Gly-Ala及Lys-Arg的突變策略尚未應用到天冬氨酸α-脫羧酶的熱穩定性改造中，本研究根據嗜熱蛋白對Ala和Arg的偏好性，對TcADC分子中Gly和Lys進行突變。

同源建模與分子表面氨基酸預測結果顯示，TcADC表面有16個Lys和5個Gly。將Lys和Gly分別突變為Arg和Ala，共構建突變體21個。重組大腸桿菌野生型及突變型菌株經IPTG誘導后，用粗酶液對突變體的酶活和熱穩定性進行初步篩選，檢測結果如圖1所示。

酶活變化檢測結果顯示，在K→R系列突變體中，大部分突變體均保留80%以上的酶活，其中K190R，K220R，K221R，K305R，K480R酶活較野生型有不同程度提升(圖1-A)，在G→A系列突變體中，G282A酶活僅剩40%，G369A酶活有所提高，其余突變體與野生型酶活相差不大(圖1-B)。

A-K→R系列突變體相對酶活；B-G→A系列突變體相對酶活圖1 突變體相對酶活Fig.1 Relative activity of mutants

突變體熱穩定性初步篩選結果如圖2所示，在50 ℃處理30 min后，突變體K221R，G369A 殘余酶活在40%以上，較野生酶有較大提高，其余突變體較野生型殘余酶活變化不大或有所下降。由于G282A酶活力明顯下降，所以未對它進行熱穩定性檢測。

A-Lys突變為Arg穩定性檢測；B-Gly突變為Ala穩定性檢測圖2 突變酶熱穩定性Fig.2 Thermal stability of mutants

2.2 突變酶的表達與純化

酶活與穩定性的初篩結果顯示突變體K221R、G369A可能具有較好催化性能。將2個突變體進行分離純化，并進行酶學性質表征。

將野生型及突變型重組菌株經IPTG誘導表達、超聲破碎，細胞破碎上清液經親和柱純化后，得到電泳純的重組蛋白，結果如圖3所示，突變酶的單體分子量與野生酶保持一致，均在64 kDa左右。

M-標準蛋白; 1-野生型;2-K221R; 3-G369A圖3 野生酶及突變酶純化結果Fig.3 Wild and mutant enzyme purified enzymes

對純化后的突變體進行酶活測定，結果表明K221R，G369A比酶活分別為(349.0±8.5)U/g，(288.0±9.0) U/g，與野生酶(290.0±9.5)U/g相比，突變體K221R酶活提高約20%，因此選擇K221R作為下一步研究對象。

2.3 突變酶K221R的酶學性質

突變體K221R酶學性質研究結果如圖4所示，該突變體最適溫度為40 ℃；最適pH為6.5；pH 6.0～7.0酶活維持在90%以上，在pH 5.5～8.0，殘余酶活在70%以上；在40 ℃處理30 min，殘余酶活為86%，在50 ℃處理30 min，殘余酶活為43%。

據高宇研究[16]，野生型酶最適反應溫度為37℃；最適pH為6.5；在pH 5.5～7.5穩定性較好，殘余酶活為75%以上；溫度穩定性較差，在40℃處理30 min，殘余酶活不足50%，在50 ℃處理30 min，酶活幾乎為0。

酶的最適反應pH及pH穩定性受表面氨基酸所形成的靜電作用網絡的影響[30]，改變表面氨基酸的帶電性質可能對酶的pH穩定性產生影響[31]。由于K221R突變沒有改變酶分子表面電荷分布，因此突變體K221R的最適pH與pH穩定性與野生型相差無幾，但是溫度穩定性較野生酶有較大的提高。

2.4 全細胞催化生成β-丙氨酸

有報道顯示，全細胞催化過程中，底物多次添加工藝優于一次性添加工藝[32]，因此我們選擇底物分批補料工藝進行基因工程菌株全細胞催化天冬氨酸生成β-丙氨酸的研究。利用K221R突變體菌株，進行全細胞催化反應。全細胞催化反應條件為pH 6.5、37 ℃，因為K221R突變體此條件下酶活及穩定性較好，適合長時間轉化。在補料次數摸索實驗中，野生型菌株全細胞催化反應補料3次(每次0.4 mol/L天冬氨酸)可以完全轉化生成β-丙氨酸，補料4次、5次均不能完全轉化，有底物殘留(數據未顯示)。K221R突變株酶活和穩定性較野生型提高，因此選擇補料4次、5次進行全細胞催化效率研究。向體積為10 mL，細胞OD600為200的反應體系中每隔4 h加入0.4 mol/L固體底物，添加4次底物，突變體K221R菌株轉化23 h生成β-丙氨酸達到1 512.24 mmol/L，約134.72 g/L，摩爾轉化率達到94.52%(圖5-A)。加入5次底物后，轉化48 h生成1 729.71 mmol/L β-丙氨酸，約154.05 g/L，摩爾轉化率86.49%(圖5-B)。補料次數增加，雖然β-丙氨酸產量有所提高，但是轉化率有所下降，有底物殘留，不利于后期產品的提純，確定最佳補料次數為4次。

A-最適反應溫度；B-熱穩定性；C-最適反應pH；D-pH穩定性圖4 K221R酶學性質Fig.4 Characterization of K221R

A-添加4次固體底物；B-添加5次固體底物圖5 K221R菌株底物分批補料催化工藝Fig.5 Fed-batch catalysis using recombinant cells expressing the K221R variant

3 結論

本文通過對鞘翅目昆蟲赤擬谷盜來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶進行分子改造，在21個突變體中得到突變體K221R，其比酶活比野生型提高20.3%，在50 ℃處理30 min的殘余酶活仍能保持43%，而相同處理條件下，野生型酶活接近于0，得到了酶活及穩定性均提高的突變體。確定全細胞催化生產β-丙氨酸的最佳工藝為：底物分批補料，反應溫度37 ℃，pH 6.5，底物添加次數4次。利用K221R菌株轉化23 h后可生成134.72 g/L β-丙氨酸，產量達到了工業生產基本要求，摩爾轉化率達到94.52%。相較于之前研究產物濃度有顯著提高，對生物法替代化學法生產β-丙氨酸具有一定促進作用。