用濾紙片上浮法探究底物濃度對過氧化氫酶活性的影響

單志瓊

(廣東省深圳市高級中學 深圳 518040)

探究環境條件對酶活性影響是課標規定實驗，尋找簡單易行的定量檢測方法，是教學活動的需要。筆者根據多年的教學經驗對該實驗進行了探索改進和優化設計，以探究底物濃度對酶促反應速率的影響為例，利用濾紙片上浮法進行探究，實驗簡單易行，原理明晰，方法科學，材料易得，結果易辨。

1 實驗原理

土豆中含有豐富的過氧化氫酶，該酶能催化過氧化氫產生水和氧氣。通過榨汁研磨取得土豆研磨濾液，用吸附固定化方法將土豆中的過氧化氫酶固定于濾紙圓片。過氧化氫分解產生的氧氣氣泡可以使濾紙圓片上浮(濾紙片上浮法)，產生的氧氣越多，上浮至表面的時間越短。

2 材料與方法

2.1 試劑器具 過氧化氫溶液，打孔器，土豆，榨汁機(豆漿機)，燒杯若干，干燥定性濾紙。

2.2 土豆提取液(含過氧化氫酶)制備 200 g的土豆切成小塊，越小越便于榨汁機榨成漿糊狀，榨之前加適量無菌蒸餾水，量以覆蓋土豆塊為準，機榨完畢進行過濾，濾液即為過氧化氫酶母液(可自定義為100單位，通過梯度稀釋制備不同濃度酶溶液)。

2.3 酶固定化 經60℃干燥后的濾紙，用打孔器制成直徑為1 cm的圓片。將濾紙圓片放入土豆提取液中浸泡，使整個濾紙片均勻地潤透過氧化氫酶。

2.4 實驗設計 用梯度法稀釋過氧化氫溶液(可將全班分成若干組，每組研究一定范圍，例如A-1組研究0.1%、 0.3%、 0.5%、 0.7%、 0.9%， A-2組研究0.2%、 0.4%、 0.6%、 0.8%、 1.0%、 2.0%等，課前合理規劃，每個梯度組保證3個以上重復)；清水為對照組。

2.5 實驗操作 取6個燒杯，編號1～6，分別裝入50 mL相應濃度的過氧化氫溶液，處理后的濾紙片每10片一組加入上述編號1～6的含有不同濃度底物的燒杯中(每組10個濾紙片同時放入)，加入濾紙片即計時(底物溶液表層接觸濾紙片即計時開始)。統計每組濾紙片全部上浮所需要的時間，并做好記錄。濾紙片全部上浮至溶液表面即計時結束。

2.6 數據處理 設置多組平行重復組，取時間平均值用于酶促反應速率計算。用所有濾紙上浮至表面所用的時間(或單位時間上浮至表面的濾紙數)倒數(1/t)表述酶促反應速率。

3 結果分析

表1是筆者課堂三組研究底物濃度對酶促反應速率影響的實驗數據匯總。從表中可以看到，不同濃度的底物中，濾紙片上浮的時間不同。3.0% H2O2中快速產生大量氣泡，濾紙片未下沉到底部，最快的上浮時間僅為6 s；反應最慢的1.0% H2O2濃度組，在50 s內完成。清水對照組濾紙片不上浮，未見氣泡，說明未發生H2O2分解反應。

以底物濃度對平均反應速率作圖(圖1)，可見酶促反應速率隨著底物濃度增加而提升。在底物濃度>1.0%時，提升速率減緩，說明一定的酶濃度范圍內，反應會達到飽和。

圖1 底物濃度對酶促反應速率的影響曲線圖

4 實驗總結

(1) 選擇合適的底物濃度范圍。底物濃度太大，反應速率快，濾紙不下沉，濃度太小，濾紙上浮速度慢，有限的課堂時間不允許。所以在進行正式實驗前必須進行預實驗確定。經過多次實驗探究，本實驗中設置的H2O2濃度梯度范圍確定為0.1%～3.0%之間。

(2) 準備足夠過氧化氫酶液，因為實驗把剛過濾得到的酶液自定義為100單位，如果實驗中途酶不夠用而重新制備酶液，就很難保證新舊酶液濃度一致，自定義100單位就失去了意義。同時，當學生都用同一批酶液去研究酶濃度的影響，不同底物濃度的影響或研究其他因素，學生的數據都可以相互參考比較和分析。

(3) 選擇合適大小的濾紙圓片。濾紙圓片過大或過小，會影響濾紙上浮的速率，如果太大過重可能根本浮不上來。經過多次修正，本實驗選擇直徑1 cm大小，最終各濃度上浮時間在5 s到1 min之間，既便于觀察又能在有限的時間內完成所有實驗。其次，各個組別濾紙圓片大小一致是探究性實驗無關變量保持一致原則的要求。制備時可選取一個作為標準再進行剪裁。

(4) 準確計時。本實驗的濾紙圓片上浮時間以秒計，所以精確計時才能得到客觀準確的結果。學生分組時最好能夠團結合作，一人發號指令，一人控制計時工具，如秒表、手機等。

(5) 做好分組和數據統計。本實驗可安排為1課時，實驗課前教師要做好細致的準備工作，首先對全班學生進行合理分組，可以3人一組，每三組研究同一個影響因素作為平行重復來進行對比分析，以節省時間。其次設計一個用于全班記錄結果的表格很有必要，便于結果統計分析，得出正確結論。

表2為筆者設計的結果記錄表，若探究其他條件可相應修改表中條件部分，此表同時可用于記錄一個班級的分組研究結果。研究者可清晰地通過這個表格橫向縱向比較結果，得出結論，深入理解酶的作用機制。此表也可以改用于探究溫度、pH、底物濃度等因子對酶促反應速率的影響。

表2 實驗結果記錄表

本實驗是典型的探究性實驗，在教授實踐過程中可以很好地讓學生體會并貫徹探究性實驗的四大原則：科學性原則、單一變量原則、對照原則和平行重復原則。同時在領悟探究性實驗的過程中，讓學生自主理解各種變量(如自變量、因變量、無關變量等)，讓學生從實驗中理解、生成并升華理論知識，同時鍛煉學生的動手操作能力，提高學生的思考和邏輯分析能力。