納米硒對肉雞六價(jià)鉻中毒的影響

趙雅麗 周東海

摘要：目前肉雞鉻中毒沒有具體明確的治療方案，納米硒在減輕重金屬中毒方面作用突出。為研究納米硒補(bǔ)充劑對鉻（VI）（K2Cr2O7）中毒肉雞的影響，通過高通量測序選取兩個(gè)改變比較大的基因ACACA和CPT1A.，以此來探索納米硒是否對肉雞鉻中毒具有預(yù)防和治療作用。試驗(yàn)將180只一日齡肉雞分成6組：空白對照組、鉻中毒組、納米硒保護(hù)組、納米硒治療組、納米硒預(yù)防組、納米硒對照組，每組3次重復(fù)。喂養(yǎng)35 d后，取出肝臟，HE染色，RT-qPCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：①鉻中毒組肉雞的肝臟切片可見細(xì)胞破裂，輪廓不清晰，細(xì)胞核破裂，核固縮，肝竇間隙增大，中央靜脈管擴(kuò)張;其他組的一部分肝臟細(xì)胞處于正常狀態(tài)，一小部分被破壞。②用納米硒治療之后，ACACA基因上調(diào)幅度降低，CPT1A基因下調(diào)幅度降低，說明納米硒可以減輕鉻對肉雞的影響。該結(jié)論為以后研究鉻中毒和治療鉻中毒提供了一個(gè)重要思路和方向。

關(guān)鍵詞：鉻中毒;納米硒;肉雞;ACACA基因;CPT1A基因

中圖分類號：S859.8? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2019）05-0010-02

鉻是一種微量元素，常見的價(jià)態(tài)為+2、+3、+6，三價(jià)鉻是對人體有益的微量元素，六價(jià)鉻的毒性較強(qiáng).一般認(rèn)為六價(jià)鉻毒性是三價(jià)鉻的1 000倍，Cr（VI） 還具有強(qiáng)氧化性和腐蝕性，因此，鉻的毒性研究主要集中在Cr（VI）化合物上[1].目前為止，人們在鉻中毒上的研究都是在大鼠，小鼠上[2]，肉雞鉻中毒研究幾乎空白，肉雞鉻中毒的預(yù)防和治療方法較少，所以我們對此進(jìn)行了研究。已知納米硒是一種新型材料，對于預(yù)防重金屬中毒有重要作用，早期在動(dòng)物的基礎(chǔ)日糧中添加諸如Na2SeO4、Na2SeO3等無機(jī)硒，這一補(bǔ)硒方式有很多明顯缺點(diǎn)，如轉(zhuǎn)化率低，對環(huán)境有害等，當(dāng)前已經(jīng)有部分國家禁止無機(jī)硒作為補(bǔ)充劑來直接使用，而廣泛使用有機(jī)硒[3-6]。鉻也是一種重金屬，因此用納米硒去預(yù)防和治療肉雞鉻中毒是可行的。

肉雞鉻中毒之后，通過高通量測序，檢測到ACACA和CPT1A這兩個(gè)基因表達(dá)量變化較大，ACACA是一個(gè)上調(diào)基因，CPT1A是一個(gè)下調(diào)基因。本試驗(yàn)主要是采用納米硒治療鉻中毒肉雞，通過HE染色和RT-qPCR觀察ACACA和CPT1A基因上調(diào)下調(diào)情況，以此來驗(yàn)證納米硒對肉雞鉻中毒是否有預(yù)防、治療和保護(hù)作用。

1? 材料與方法

1.1? 材料

一日齡肉雞（購于宜昌正大畜牧武漢分公司）;重鉻酸鉀（化學(xué)式：K2Cr2O7;分子質(zhì)量：294.19;基準(zhǔn)級，天津天灝化工廠生產(chǎn)，含量99.8%以上）;納米硒（含量99.99%以上，200目，平均粒徑40 nm）;伊紅染色液;蘇木素染液;10%福爾馬林溶液; RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢谷歌生物公司）;初級兔單克隆抗ACACA和CPT1A抗體（武漢AB克隆技術(shù)公司）。

1.2? 方法

急性試驗(yàn)：選取健康雛雞20只適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組5只。依照預(yù)試驗(yàn)中確定的雛雞致死濃度范圍，按Horn氏法設(shè)計(jì) K2Cr2O7劑量如下：0.100、0.464、1.000和2.150 g/kg體重。經(jīng)口灌胃染毒，灌胃容積按照各自雛雞體重的1%計(jì)算，灌胃前將試驗(yàn)用雛雞禁食6 h，飲水不限，觀察14 d。根據(jù)Horn表計(jì)算得出K2Cr2O7對雛雞的半數(shù)致死量（LD50）為0.464 g/kg體重，95%可信限為2.98～7.23[7，8]。

1.3? 造模

180只AA一日齡雛雞，飼養(yǎng)1周之后分為6組：空白對照組（基礎(chǔ)日糧和清水）、鉻中毒組[0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7）、納米硒對照組（基礎(chǔ)日糧和0.5 mg/（kg·d）的納米硒]、納米硒保護(hù)組[0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7和0.5 mg/（kg·d）納米硒同時(shí)飼喂]、納米硒治療組[飼喂2周0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7之后加入0.5 mg/（kg·d）納米硒飼喂]、納米硒預(yù)防組[飼喂2周 0.5 mg/（kg·d）納米硒后再加入0.037 g/（kg·d）的K2Cr2O7飼喂]。試驗(yàn)雞采用舍內(nèi)籠養(yǎng)，自由采食飲水。育雛時(shí)溫度控制在34 ℃左右，然后每周控制溫度下降2～3 ℃直至恒溫，直到試驗(yàn)結(jié)束[9，10]。

1.4? HE染色

35 d之后，處死肉雞，按照試驗(yàn)要求取肝臟，用生理鹽水清洗，然后迅速放入4%多聚甲醛固定液中固定，24 h后進(jìn)行組織蠟塊制作。

1.5? RT-qPCR

根據(jù)試驗(yàn)要求提取總RNA，然后電泳檢測RNA的穩(wěn)定性.之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再根據(jù)NCBI主頁GeneBank已公布的目的基因序列，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，同時(shí)參考文獻(xiàn)中提及的引物序列。引物設(shè)計(jì)見表1。之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，熒光定量體系見表2。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 生長特征觀察

在整個(gè)試驗(yàn)過程中，空白對照組和納米硒對照組雞的行為特征，體重以及剖檢病變無異常;鉻中毒組雞的精神不佳，體型偏小，被毛粗亂無光澤;添加納米硒組雞比鉻中毒組雞體型稍大，體重增加，精神狀態(tài)良好。試驗(yàn)過程中無試驗(yàn)動(dòng)物死亡。

2.2? 病理切片觀察

肉雞肝臟組織病理切片見圖1。圖1a和圖1f為空白對照組和納米硒對照組，可見其細(xì)胞膜、細(xì)胞核清晰，肝竇隙均正常;圖1b為鉻中毒組的肝臟切片，可見其細(xì)胞破裂，輪廓不清晰，細(xì)胞核破裂，核固縮，肝竇間隙增大，中央靜脈管擴(kuò)張;圖1c為納米硒保護(hù)組的肝臟切片，可見其一部分肝細(xì)胞處于正常狀態(tài)，小部分被破壞;納米硒治療組（圖1d）和納米硒預(yù)防組（圖1e）肝細(xì)胞比鉻中毒組的肝細(xì)胞狀態(tài)好。

2.3? Rt-qPCR

圖2顯示了35 d肉雞肝細(xì)胞內(nèi)ACACA基因的相對表達(dá)水平。與空白對照組比較，鉻中毒組的ACACA基團(tuán)表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與鉻中毒組相比，納米硒對照組、納米硒保護(hù)組、納米硒治療組及納米硒預(yù)防組的肝臟樣本中的ACACA基因相對表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05）。

圖3顯示了35 d肉雞肝臟的CPT1A基因相對表達(dá)水平。與空白對照組相比，鉻中毒組CPT1A基因相對表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與鉻中毒組相比，添加納米硒的4個(gè)組CPT1A 相對表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05）。

3? 討論

通過納米硒預(yù)防和治療肉雞鉻中毒試驗(yàn)可知，使用納米硒添加劑之后，肉雞的體重、毛色、肝臟病理狀態(tài)都有所好轉(zhuǎn);ACACA和CPT1A兩個(gè)基因的表達(dá)水平比鉻中毒狀態(tài)下的改變幅度降低。由此可知，納米硒對肉雞鉻中毒有預(yù)防和保護(hù)作用，該結(jié)論可為今后研究肉雞鉻中毒的機(jī)理提供參考。

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