相溶解度法研究環糊精對山奈酚的增溶作用

陸蘭芳，楊鵬，王展，汪卓琳，于博*

(1.湖北文理學院 食品科學技術學院，湖北 襄陽 441053; 2.武漢輕工大學 食品科學與工程學院，武漢 430023)

山奈酚(kaempferol)是一種黃酮類化合物，幾乎不溶于水，來源于姜科植物山奈的根、莖以及檀香科植物百蕊草的提取物。山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、防治糖尿病、動脈粥樣硬化和骨質疏松、保護神經、肝臟和心肌以及抑制蛋白激酶活性等營養保健功能[1-5]，在食品、藥品等領域有著非常廣闊的應用前景；但是山奈酚幾乎不溶于水，這極大地限制了其應用范圍。環糊精分子具有剛性錐形空腔結構，外部親水、內部疏水，能包合疏水性客體分子，起到提高溶解度和穩定性的作用，基于主客體相互作用的環糊精分子微膠囊是一種提高疏水性生物活性分子溶解性和穩定的可靠技術手段。采用相溶解度法，能夠研究難溶性客體分子在環糊精存在下的溶解度變化規律，并計算其穩定常數，這在環糊精微膠囊領域研究日益廣泛[6-12]。本文采用相溶解度法系統地研究了常用的環糊精對山奈酚的包合作用、增溶作用以及包合過程中有關熱力學參數的變化規律，以期為山奈酚的微膠囊化應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-環糊精(α-CD)、β-環糊精(β-CD)、γ-環糊精(γ-CD)、甲基-β-環糊精(M-β-CD)、2-羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)、麥芽糖基-β-環糊精(Mal-β-CD) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山奈酚、磺丁基-β-環糊精(SBE-β-CD)、羥乙基-β-環糊精(HE-β-CD) 上海源葉生物科技有限公司；甲醇(分析純) 西隴科學股份有限公司。

AL204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-2600PC紫外可見光分光光度計 島津企業管理(中國)有限公司；QYC-200全溫培養搖床 上海新苗醫療器械制造有限公司；PGJ-10-AS(超)純水機 武漢品冠儀器設備有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山奈酚的標準曲線

準確稱取0.0286 g的山奈酚，用無水乙醇溶解并轉移至100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，配得0.001 mol/L山奈酚母液，轉移至棕色試劑瓶置于冰箱中保存備用。分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL的0.001 mol/L的山奈酚母液于7個10 mL的棕色離心管中，用無水乙醇定容至刻度，配得1.0×10-5～7.0×10-5mol/L一系列濃度梯度的山奈酚溶液，以無水乙醇作為空白對照，在波長367 nm處測定不同濃度山奈酚溶液的吸光度。以山奈酚的濃度為橫坐標，各濃度下的吸光度為縱坐標，繪制山奈酚的標準曲線。

1.2.2 不同環糊精濃度下的山奈酚增溶試驗

準確稱取適量不同環糊精，用超純水溶解，混合均勻，分別配得0.01 mol/L的環糊精水溶液各100 mL。吸取濃度為0.01 mol/L的環糊精水溶液0，2，4，6，8，10 mL于6個棕色玻璃瓶中，然后分別加入10，8，6，4，2，0 mL超純水，配成10 mL濃度分別為0×10-3，2×10-3，4×10-3，6×10-3，8×10-3，10×10-3mol/L的環糊精溶液[13]。均加入過量的山奈酚，超聲10 min，再置于搖床中，設置轉速為120 r/min，溫度分別為25，37，45 ℃，時間為72 h，振搖結束后靜置，待溶液達到平衡，用0.45 μm的濾膜過濾，取濾液1 mL于10 mL的棕色離心管中，超純水定容，在波長367 nm測定不同濃度環糊精下山奈酚的吸光度[14,15]。根據標準曲線求出相應環糊精濃度下山奈酚的溶解度，以環糊精濃度為橫坐標，山奈酚的溶解度為縱坐標，繪制相溶解度曲線。判定線型關系，并計算包合常數和熱力學參數。

1.2.3 環糊精/山奈酚包合過程的熱力學計算

山奈酚與不同環糊精在不同溫度(25，37，45 ℃)下的包合常數K，結合Van's Hoff方程可得：

△G=-RTlnK。

(1)

△G=△H-T△S。

(2)

可計算熱力學參數△G。由方程(1)和(2)可得：

(3)

以lnK對1/T作線性回歸，根據直線的斜率和截距計算熱力學參數△H和△S[16,17]。

2 結果與討論

2.1 山奈酚的標準曲線

山奈酚的標準曲線，見圖1。

圖1 山奈酚的標準曲線Fig.1 Standard curve of kaempferol

由圖1可知,回歸方程為y=0.1952x-0.0115，R2=0.9986，表明濃度在0～7.0×10-5mol/L范圍內山奈酚的濃度與吸光度線性關系良好。

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2.2 山奈酚的相溶解度曲線

按1.2.2的方法計算不同溫度下不同濃度環糊精溶液中的山奈酚含量，通過山奈酚與環糊精濃度的對應關系，選擇合適的橫縱坐標，繪制山奈酚在25，37，45 ℃條件下的相溶解度曲線，結果見圖2～圖4。

圖2 25 ℃時環糊精對山奈酚溶解度的影響Fig.2 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 25 ℃

圖3 37 ℃時環糊精對山奈酚溶解度的影響Fig.3 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 37 ℃

圖4 45 ℃時環糊精對山奈酚溶解度的影響Fig.4 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 45 ℃

由圖2～圖4可知，同一溫度下山奈酚的濃度隨著環糊精濃度的增加呈現良好的線性關系，相溶解度曲線為AL型，說明環糊精與山奈酚形成了1∶1的包合物。隨著環糊精濃度的依次增大，山奈酚的溶解度逐次遞增，在25，37，45 ℃下，SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD所在線段的斜率很高，說明對山奈酚增溶效應較為明顯，γ-CD、β-CD、Mal-β-CD、α-CD斜率則很小且相溶解度曲線很接近。增溶效果的順序為SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD。

2.3 環糊精/山奈酚包合常數的計算

包合穩定常數是衡量包合物穩定性的重要參數，它反映了環糊精與藥物分子形成包合物時結合力的強弱，K值越大，包合效果越好，包合常數K值理論上只有AL型的溶解等溫線才可求出，而AN型計算較困難，一般將曲線開始的直線部分進行線性回歸。

包合穩定常數K=斜率/[ So×(1-斜率)]。

式中：斜率為相溶解度曲線的斜率；So為山奈酚在各溫度下水中的飽和溶解度[18,19]。

表1 環糊精對山奈酚的線性回歸方程 及包合常數KTable 1 Linear regression equation and inclusion constant K of cyclodextrin to kaempferol

由表1可知，在不同溫度下，8種環糊精對山奈酚的增溶都呈現出較好的線性關系，隨著溫度的升高，α-CD、β-CD、γ-CD、M-β-CD、SBE-β-CD、HE-β-CD、HP-β-CD對山奈酚的包合常數逐漸增大，說明升高溫度有利于這7種環糊精與山奈酚包合平衡；而Mal-β-CD對山奈酚的包合常數隨著溫度的升高而減小，說明升高溫度，不利于包合平衡。在同一溫度下，8種環糊精對山奈酚的包合常數的大小順序SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD，這可能與各種環糊精不同的空間結構有關。SBE-β-CD對山奈酚的包合常數最大，在45 ℃時達到19082.1 mol/L，這是由于SBE-β-CD有帶負電荷的磺丁基，其基團比-OH有更強的親水性，在水中的溶解度很好，能夠包合山奈酚并極大地提高其在水中的溶解度。

2.4 環糊精/山奈酚包合過程的熱力學計算

山奈酚與環糊精包合過程的熱力學參數見表2。

表2 山奈酚與環糊精包合過程的熱力學參數Table 2 Thermodynamic parameters of inclusion process of kaempferol and cyclodextrin

由表2可知，環糊精在不同溫度下與山奈酚包合的吉布斯自由能變化△G<0，表明環糊精與山奈酚的包合自發進行，隨溫度升高，其負值逐漸增大，說明高溫使包合的自發傾向增大；△H>0，表明環糊精與山奈酚的包合反應為吸熱反應，升高溫度有利于包合反應， Mal-β-CD與山奈酚包合的△H<0，說明此包合反應為放熱反應，升高溫度不利于包合的進行；△S>0，表明環糊精與山奈酚的包合反應為熵增反應，根據熱力學第二定律，疏水作用在包合過程中起主要作用。

2.5 不同環糊精對山奈酚增溶效應分析

根據相溶解度的方法，測定不同溫度下山奈酚在8種環糊精的5個濃度中的溶解度和山奈酚在不同溫度下水中的飽和溶解度，分析環糊精對山奈酚的增溶效應(S/So)，其中S/So為增溶因子，表示各種環糊精對山奈酚的增溶作用；S為山奈酚在各種環糊精中的濃度；So為山奈酚在水中的飽和溶解度[14]。山奈酚在25，37，45 ℃的水中的溶解度分別為7.0×10-5，8.0×10-5，9.0×10-5mol/L，不同濃度的環糊精對山奈酚的增溶效果見表3。

表3 環糊精對山奈酚的增溶效應Table 3 Solubilization effect of cyclodextrin on kaempferol

由表3可知，環糊精對山奈酚的增溶效果隨著環糊精濃度的增大而呈現遞增的趨勢。同一種環糊精，隨著溫度的增加，環糊精對山奈酚的增溶效果增加。不同的環糊精對山奈酚的增溶效果差異顯著，α-CD、β-CD、γ-CD對山奈酚的增溶作用很小，而SBE-β-CD對山奈酚的增溶作用極其顯著，SBE-β-CD的濃度在1×10-2mol/L、溫度為45 ℃時，其對山奈酚的增溶因子高達70.03，增溶效應順序為SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD。

3 結論

采用相溶解度法系統地研究了8種環糊精對山奈酚的增溶作用及包合過程中的熱力學參數，初步揭示了環糊精包合山奈酚的熱力學規律。研究表明山奈酚的溶解度隨著8種環糊精濃度的增加而呈線性遞增的趨勢，相溶解度曲線為AL型，環糊精與山奈酚形成的包合物類型為1∶1型，增溶效應與環糊精濃度和溫度呈正相關，增溶效應順序為SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD，α-CD的增溶效應極小，而SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD的增溶效應明顯。吉布斯自由能變化△G<0，包合過程為自發進行；Mal-β-CD與山奈酚的焓變△H<0，此包合過程為放熱反應，其他7種環糊精與山奈酚的△H>0，說明此包合過程為吸熱反應，升高溫度有利于包合的進行；熵變△S>0，包合過程熵增。因此，可以根據山奈酚的應用領域，選擇SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD包合山奈酚，提高山奈酚的溶解度，拓展山奈酚的應用范圍。