基于高通量測序研究文獻和預測微生物學軟件的泡菜中常見食源性致病菌風險分析

閆鳴霄，吳正云，全江龍，張文學

(四川大學 輕紡與食品學院食品工程系，成都 610065)

泡菜是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜制品，一般以新鮮蔬菜為主要原料，輔以大蒜、生姜等調(diào)味料，添加適量鹽，經(jīng)自然發(fā)酵或添加外源發(fā)酵劑發(fā)酵，形成了其獨特的風味和香氣。泡菜發(fā)酵中涉及大量的微生物，除乳酸菌外，原料和操作環(huán)境中可能帶入包括食源性致病菌在內(nèi)的各種污染微生物[1-4]。目前對泡菜中污染微生物的研究仍以傳統(tǒng)的培養(yǎng)計數(shù)方法為主，近年來，高通量測序技術(shù)的發(fā)展為泡菜微生物檢測提供了更為高效、準確的方法。但目前泡菜微生物高通量測序研究多集中在多樣性分析方面，對食源性致病菌關(guān)注不多。預測微生物學采用數(shù)學方法描述微生物數(shù)量變化和環(huán)境因子之間的響應(yīng)關(guān)系，能為在不同條件下發(fā)酵泡菜中食源性致病菌的生長趨勢探討提供參考。

本研究基于泡菜微生物高通量測序的文獻數(shù)據(jù)和預測微生物學數(shù)據(jù)庫軟件模擬的微生物生長結(jié)果，探究了一些發(fā)酵操作條件對泡菜中常見食源性致病菌污染風險的影響，初步分析了不同發(fā)酵條件下泡菜發(fā)酵前期幾種食源性致病菌生長的風險。

1 材料與方法

1.1 高通量測序研究文獻數(shù)據(jù)的獲取及分析

在CNKI和Web of Science數(shù)據(jù)庫中，利用“泡菜”、“高通量”、“PCR”、“多樣性”等關(guān)鍵詞，以建庫到2018年7月為時間范圍，進行相關(guān)文獻檢索。然后通過人工方式對所得文獻再次篩選，剔除重復和無效文獻。要求最終所選文獻包含通過高通量測序手段測得的泡菜中食源性致病菌多樣性的信息，除此之外，還應(yīng)包括泡菜的樣品類別、發(fā)酵方式、發(fā)酵原料、發(fā)酵劑類型、發(fā)酵溫度、發(fā)酵鹽度以及泡菜輔料等。根據(jù)NCBI的物種分類數(shù)據(jù)庫確定各種食源性致病菌的分類關(guān)系(見表1)，以1和0分別表示某一致病菌或其所在的分類在泡菜樣品中存在或不存在；文獻中未提及的數(shù)據(jù)標記為缺失。相關(guān)性分析采用SAS 6.12進行。

表1 常見食源性致病菌的微生物學分類Table 1 The microbiological classification of common food-borne pathogens

1.2 基于Comebase數(shù)據(jù)庫軟件的常見食源性致病菌在泡菜發(fā)酵前期的生長趨勢預測

采用Combase數(shù)據(jù)庫的Predictor軟件，選擇在泡菜發(fā)酵前期可能出現(xiàn)的鹽度、pH和溫度條件，對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌(有亞硝酸鹽)、蠟狀芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和假單胞菌8種食源性致病菌的生長趨勢進行模擬分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于泡菜微生物高通量測序研究文獻數(shù)據(jù)的致病菌污染風險分析

根據(jù)前述標準，分別在CNKI和Web of Science數(shù)據(jù)庫中檢索到68篇和29篇文獻，通過人工方式再次篩選，各得到7篇和8篇，共計15篇符合要求的文獻[5-19]，總計43個泡菜樣本。其中，涉及的樣品類別有家庭泡菜和工業(yè)泡菜；發(fā)酵時間為1～65.5 d；發(fā)酵劑類型有自然發(fā)酵、泡菜母水發(fā)酵和發(fā)酵劑發(fā)酵；發(fā)酵原料有白蘿卜、胡蘿卜、白菜、雪菜、榨菜、豇豆、青菜、芥菜、辣椒、混合原料(白蘿卜+胡蘿卜)、混合原料(白菜+胡蘿卜+白蘿卜)、混合原料(白菜+胡蘿卜+豇豆)；泡菜輔料有混合輔料(生姜+辣椒+花椒)、混合輔料(辣椒+花椒)、混合輔料(生姜+胡椒+青椒)、混合輔料(生姜+辣椒+大蒜)；發(fā)酵溫度為18.5～25 ℃；發(fā)酵鹽度為2%～11%。

根據(jù)泡菜中常見食源性致病菌的生物學分類統(tǒng)計(見圖1)，常見的食源性致病菌大腸桿菌和沙門氏菌分別所在的埃希氏菌屬和沙門氏菌屬在43個泡菜樣品中未檢出，但其所屬的腸桿菌科在絕大部分泡菜樣品中檢出。腸桿菌科下的腸桿菌屬檢出較多，志賀菌屬和克呂沃爾氏菌屬、沙雷氏菌屬、泛菌屬等條件致病菌也有檢出。從這些結(jié)果看，在泡菜的發(fā)酵制作中腸桿菌科微生物存在較多。腸桿菌科中大腸桿菌較為常見，但在本次所分析的泡菜樣品中未檢出，分析其原因是其在泡菜發(fā)酵后期消失。

金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、蠟狀芽孢桿菌所在的各屬有檢出。分析原因在于其各自具有不同的耐鹽耐酸性機制。金黃色葡萄球菌由于細胞壁含多層肽聚糖和細胞表面特殊的鹽應(yīng)激蛋白而具有獨特的耐鹽特性[20]；單核細胞增生李斯特菌具有多種抗酸應(yīng)激系統(tǒng)[21,22]；蠟狀芽孢桿菌芽孢的特殊結(jié)構(gòu)使其相對耐鹽耐酸[23]。

假單胞菌屬被檢出較多，致病菌銅綠假單胞菌也多次檢出。分析原因是發(fā)酵泡菜水可能受到污染[24]或者操作人員手未經(jīng)消毒直接接觸原料、水和發(fā)酵容器等。產(chǎn)氣莢膜梭菌所屬梭菌屬也有檢出。

圖1 泡菜樣品中食源性致病菌在屬(A)、 科(B)、目(C)水平上的相對檢出率Fig.1 The relative detection rates of common food-borne pathogens in pickle samples in the genera (A), the families(B) and the divisions(C) levels

泡菜發(fā)酵操作方式與常見食源性致病菌所屬分類檢出的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：泡菜類別、發(fā)酵時間、發(fā)酵劑類型、發(fā)酵原料、發(fā)酵溫度、發(fā)酵鹽度以及泡菜輔料等因素與食源性致病菌的出現(xiàn)之間有一定相關(guān)性。

泡菜樣品類別與腸桿菌目、腸桿菌科和假單胞菌目、假單胞菌科的出現(xiàn)呈極顯著相關(guān)性(相關(guān)性系數(shù)>0.5)，即家庭泡菜出現(xiàn)腸桿菌屬和假單胞菌屬致病菌的頻率更高，分析其原因是家庭泡菜鹽度較低且制作過程中衛(wèi)生條件控制相對較差；而李斯特菌屬則更多出現(xiàn)在工業(yè)泡菜中，分析是由于其耐鹽性較強，因而在鹽度較高的工業(yè)泡菜中更易存活。

在各種泡菜原料中，蘿卜、白菜泡菜中出現(xiàn)致病菌的概率較高，推測是由于這兩種原料本身帶菌較多或其所含的營養(yǎng)物質(zhì)豐富有利于致病菌生長繁殖。

發(fā)酵時間越長，葡萄球菌屬和李斯特菌屬致病菌檢出率越高，而假單胞菌屬致病菌檢出率越低。分析其原因是發(fā)酵時間長(即發(fā)酵過程緩慢，多出現(xiàn)于高鹽度發(fā)酵中)，pH降低緩慢，使得耐酸和耐鹽性較強的葡萄球菌屬和李斯特菌易于存活。

使用發(fā)酵劑發(fā)酵的泡菜中梭菌屬檢出較多，推測發(fā)酵劑可能受到梭菌屬污染，具體原因有待進一步探究。

發(fā)酵溫度與假單胞菌屬的檢出呈明顯的負相關(guān)性(相關(guān)性系數(shù)>0.5，P<0.01)，分析原因是泡菜樣品中出現(xiàn)的假單胞菌多為適宜在低溫下生長的菌種。有研究顯示銅綠假單胞菌最適生長溫度為30～35 ℃[25]，但也有研究顯示莓實假單胞菌、熒光假單胞菌在0～7 ℃時仍保持較高活力[26]，對于假單胞菌種類與溫度之間的響應(yīng)機制仍需深究。

泡菜輔料和發(fā)酵鹽度與泡菜中食源性致病菌的相關(guān)性不明顯，可能是由于所選文獻中的有關(guān)數(shù)據(jù)不足。

2.2 基于預測微生物軟件的泡菜發(fā)酵前期常見食源性致病菌的生長趨勢預測

傳統(tǒng)的工業(yè)泡菜生產(chǎn)中多采用高鹽度(10%以上)發(fā)酵。由于高鹽發(fā)酵食物可能誘發(fā)糖尿病、心臟病、高血壓等疾病[27，28]，中低鹽度(2%～5%)發(fā)酵成為泡菜生產(chǎn)的趨勢之一。在泡菜發(fā)酵中起始pH一般為 6～6.5，隨著發(fā)酵的進行，pH逐漸下降并最終達到3～4[29]。研究顯示，雜菌數(shù)量在泡菜發(fā)酵前期通常有一定程度增加，達到峰值后逐漸下降[30]。多數(shù)食源性致病菌所能耐受的最低pH為4.5～5，因此在泡菜后期不能生長，但在泡菜發(fā)酵前期pH較高的條件下，仍可能出現(xiàn)生長而引起風險，尤其是短期發(fā)酵和即食泡菜中。

采用Predictor軟件對幾種常見食源性致病菌的生長趨勢模擬結(jié)果顯示，隨著pH的降低和鹽濃度的提高，各種食源性致病菌生長總體上明顯減緩。在pH 4.5條件下，耐酸能力較弱的蠟狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和志賀氏菌等不能生長。在高鹽濃度(10%)下，多數(shù)致病菌不能生長，但金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌仍可能生長，其中金黃色葡萄球菌的生長優(yōu)勢更明顯(詳細數(shù)據(jù)略)。在中等鹽濃度(4.6%)下，沙門氏菌生長速率最快，其次為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和單核細胞增生李斯特菌(見圖2A)。在低鹽濃度(2%)下，幾種致病菌、尤其是大腸桿菌生長速度明顯加快(見圖2B)。

由圖2可知，大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌在中、低鹽濃度泡菜發(fā)酵前期都有可能出現(xiàn)明顯的生長。關(guān)于泡菜中大腸桿菌的報道較多[31]，單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌在泡菜中的檢出也有報道，但在上述模擬分析中尤其具有明顯生長優(yōu)勢的沙門氏菌在泡菜中的檢出尚未見報道，分析可能有兩方面原因：高通量測序樣品偏少，且多數(shù)未針對發(fā)酵前期進行檢測；蔬菜中的沙門氏菌分布不多，隨著發(fā)酵過程進行而迅速死亡。由于沙門氏菌較高的危害性，對于其是否能在泡菜前期繁殖和消失規(guī)律有待于進一步考察。

圖2 采用Predictor軟件對中、低鹽度泡菜發(fā)酵前期 條件下大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單 核細胞增生李斯特氏菌生長趨勢的預測Fig.2 The prediction of growth trend of Enterobacter, Salmonella, S.aureus and L.monocytogenes in prophase pickle fermentation under conditions of medium and low salinity by using Predictor software

注：溫度為25 ℃；pH為4.5；A為鹽度4.6%；B為鹽度2%。

在家庭泡菜制作中，因使用的鹽度一般較低，相對更易受到上述幾種腸桿菌科致病菌的污染。在工業(yè)泡菜制作中，由于鹽度偏高，腸桿菌科致病菌不易生長，而金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌因耐鹽性較強有可能出現(xiàn)生長，這與前文對高通量測序的分析結(jié)果保持一致。

3 結(jié)論

對發(fā)酵泡菜中常見食源性致病菌高通量測序的文獻數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，泡菜發(fā)酵操作和泡菜中食源性致病菌的出現(xiàn)有明顯的關(guān)聯(lián)。家庭泡菜易出現(xiàn)腸桿菌屬和假單胞菌屬致病菌，而工業(yè)泡菜中李斯特菌屬致病菌出現(xiàn)機會較大；蘿卜、白菜泡菜中出現(xiàn)致病菌的機會相較其他泡菜原料更大；發(fā)酵時間與葡萄球菌屬和李斯特菌屬致病菌出現(xiàn)表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)。

采用Predictor軟件對泡菜發(fā)酵前期的模擬分析結(jié)果顯示，高鹽泡菜中金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌有可能生長；中、低鹽泡菜中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都可能出現(xiàn)明顯生長，沙門氏菌尤其具有較大的生長優(yōu)勢。