迷迭香多酚提取工藝響應面優化及抑制李斯特菌活性研究

耿敬章

(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000)

迷迭香屬于唇形科的芳香植物，具有豐富的使用價值[1,2]，在我國云南、貴州、廣西、海南等地有種植。迷迭香是一種名貴的天然香料植物，在生長季節會散發一種清香氣味[3,4]。迷迭香是西餐中經常使用的香料，經常使用在牛排、土豆等料理以及烤制品中。同時，迷迭香還被廣泛用于醫藥、油炸食品、食品保鮮等[5,6]。研究表明，這些功能主要與迷迭香化學成分中的酚類和揮發油類有關[7]。迷迭香提取物中除了有熊果酸、α-蒎烯等物質外，還有鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酸、迷迭香酚等二萜酚類物質。其中，二萜酚類物質具有明顯的抗微生物活性，在抗菌、消炎方面發揮巨大作用[8]。李斯特菌存在于絕大多數食品中，肉類、蛋類、海產品、蔬菜等都已被證實是李斯特菌的感染源[9-11]。因此，本文研究迷迭香多酚提取工藝及其抑制李斯特菌活性，以期對迷迭香多酚資源進行深層次挖掘和利用。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑

迷迭香：購于當地中藥材批發市場；乙醇、沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、石油醚等：中國醫藥(上海)化學試劑公司；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)：上海緣肽生物技術有限公司；單增李斯特菌種：省農科院提供；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器與設備

電動攪拌機 江西安亭儀器設備廠；HZX-JA100電子天平 北京新陽儀器設備有限公司；DK-8D超級水浴鍋 華立設備公司；721G型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；循環真空泵 天津貝納儀器設備有限公司；超聲波發生儀 北京天輝化工設備有限公司；旋轉蒸發儀、真空干燥箱 安徽高博科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 迷迭香多酚提取工藝流程

迷迭香干葉→篩選→鼓風干燥→粉碎→篩分→乙醇→超聲波提取→濾渣再提取→合并濾液→萃取→濃縮→真空干燥→迷迭香多酚提取物[12]。

1.3.2 指標測定

總酚含量：Folin-Ciocalteu法測定總酚含量[13]。

提取率=(C×V/m)×100%。

式中：C為提取液總酚含量，mg/mL；V為體積，mL；m為原料質量，g[14]。

1.3.3 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性實驗

TSB培養基接種單增李斯特菌，37 ℃ 200 r/min搖床培養24 h，然后離心，添加生理鹽水，獲得200 CFU/mL菌懸液備用。用移液器吸取迷迭香多酚菌懸液到TSA培養基，然后涂布均勻，再加1%吐溫80，稀釋為200，100，50，25，12.5，6.25 mg/mL 6個梯度。以1%吐溫80為空白對照實驗，測抑菌圈直徑，平行實驗3次[15-17]。

2 結果與分析

2.1 液料比對提取迷迭香多酚的影響

設定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取6，10，14，18，22，26 6個水平的液料比提取迷迭香多酚，檢測迷迭香多酚。有效成分提取的過程實質是一個傳質過程，因此操作條件中的液料比對提取效果至關重要[18]。

圖1 液料比對提取迷迭香多酚的影響Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the extraction of rosemary polyphenols

由圖1可知，液料比小于18時，提取率逐漸提高，這是因為迷迭香多酚不斷從固體原料向液體溶劑傳質，溶劑的滲透和有效成分的溶解進行較快。當液料比為18時，迷迭香多酚提取效果較好，提取率達到最大。當液料比大于18時，提取率反而降低，這可能是因為較高的液料比增加了傳質推動力，使得提取效果下降。同時使用大量的溶劑會對實驗后處理操作造成負擔。因此，綜合考慮，迷迭香多酚提取過程中，液料比為18較為適宜。

2.2 乙醇濃度對提取迷迭香多酚的影響

設定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取50%、55%、60%、65%、70%、75% 6個水平的乙醇濃度提取迷迭香多酚，檢測迷迭香多酚。乙醇作為一種極性較強的溶劑，能提取出極性強或極性較弱的有效物質[19]。乙醇濃度的變化能影響提取物密度、黏度、介電常數等物理性質，進而影響提取率。

圖2 乙醇濃度對提取迷迭香多酚的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction of rosemary polyphenols

由圖2可知，迷迭香多酚的提取率隨乙醇濃度的提高先增大后減小。當乙醇濃度分別為50%、55%時，迷迭香多酚提取率逐漸提高，當乙醇濃度提高到60%時，迷迭香多酚提取率達到最高，說明乙醇對提取多酚效果較好。當乙醇濃度大于60%時，迷迭香多酚提取率反而下降，這可能是由于其他一些弱極性成分溶出量增加，減緩了酚類物質向乙醇溶劑的擴散。因此，迷迭香多酚提取過程中，乙醇濃度為60%較為適宜。

2.3 超聲波功率對提取迷迭香多酚的影響

設定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取200，250，300，350，400，450 W 6個水平的超聲波功率提取迷迭香多酚，檢測迷迭香多酚。超聲波輔助提取是天然產物中有效成分提取的一個好方法，它操作簡單，節省能耗，提取效果有保證[20]。

圖3 超聲波功率對提取迷迭香多酚的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of rosemary polyphenols

由圖3可知，隨著超聲波功率提高，迷迭香多酚提取率呈先上升后下降的趨勢，當超聲波功率為350 W時，迷迭香多酚提取率達到最高。這是由于隨著超聲功率提高，超聲波引起的“空化效應”加強，迷迭香多酚滲透速率加快。但是，當超聲波功率大于350 W時，高壓環境致使迷迭香多酚的結構受損，且雜質溶出嚴重，導致迷迭香多酚提取率降低。因此，迷迭香多酚提取過程中，超聲波功率為350 W較為適宜。

2.4 超聲波時間對提取迷迭香多酚的影響

設定提取迷迭香多酚其他各因素條件，選取10，20，30，40，50，60 min 6個水平的超聲波時間提取迷迭香多酚，檢測迷迭香多酚。

圖4 超聲波時間對提取迷迭香多酚的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction of rosemary polyphenols

由圖4可知，超聲時間低于40 min時，迷迭香多酚提取率逐漸上升，當超聲波時間為40 min時，提取率最大，之后逐漸下降。這可能是因為超聲提取開始時，細胞破碎逐漸增加，因此迷迭香多酚含量不斷提高。當超聲40 min后，超聲時間過長，迷迭香多酚已基本溶出且部分被損壞，所以提取率下降。因此，迷迭香多酚提取過程中，超聲波時間為40 min較為適宜。

2.5 迷迭香多酚提取工藝條件優化實驗

表1 響應面優化提取條件的因素和水平 Table 1 Factors and levels of optimizing the extraction conditions by response surface methodology

表2 迷迭香多酚提取條件實驗結果Table 2 Experimental results of extraction conditions of rosemary polyphenols

續 表

由表1可知，迷迭香多酚提取條件中，液料比、乙醇濃度、超聲波功率、超聲波時間對結果影響顯著。以下為提取率二次回歸擬合方程：

提取率(%)=4.22—0.065A-0.10B+0.50C+0.080D-0.028AB-0.10AC-0.095AD-0.42BC+0.016BD+0.086CD-0.50A2-0.16B2-0.57C2-0.45D2。

式中：A是液料比，B是乙醇濃度，C是超聲波功率，D是超聲波時間。迷迭香多酚提取條件實驗結果見表2，響應面實驗結果分析見表3。

表3 響應面實驗結果分析Table 3 Analysis of experimental results of response surface methodology

注：若“Prob>F”<0.05，表示因素為顯著因素。

迷迭香多酚提取實驗失擬項不顯著，P值為0.8867，模型極顯著，P值<0.0001，所以能對提取迷迭香多酚的條件進行預測。得到迷迭香多酚提取的最佳條件為液料比15，乙醇濃度56%，超聲波功率376 W，超聲波時間38 min。

圖5 液料比和乙醇濃度的相互作用Fig.5 Interaction between liquid-material ratio and ethanol concentration

由圖5可知，液料比與乙醇濃度的相互作用對提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著液料比與乙醇濃度的增大，提取率先增后減，變化幅度不大。

圖6 液料比和超聲波功率的相互作用Fig.6 Interaction between liquid-material ratio and ultrasonic power

由圖6可知，液料比與超聲波功率的相互作用對提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著液料比與超聲波功率的提高，提取率先增后減，變化幅度較大。

圖7 液料比和超聲波時間的相互作用Fig.7 Interaction between liquid-material ratio and ultrasonic time

由圖7可知，液料比與超聲波時間相互作用對提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著液料比與超聲波時間的提高，提取率先增后減，變化幅度不大。

圖8 乙醇濃度和超聲波功率的相互作用Fig.8 Interaction between ethanol concentration and ultrasonic power

由圖8可知，乙醇濃度與超聲波功率的相互作用對提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著乙醇濃度與超聲波功率的提高，提取率先增后減，變化幅度較大。

圖9 乙醇濃度和超聲波時間的相互作用Fig.9 Interaction between ethanol concentration and ultrasonic time

由圖9可知，乙醇濃度與超聲波時間的相互作用對提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著乙醇濃度與超聲波時間的提高，提取率先增后減。

圖10 超聲波功率和超聲波時間的相互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic power and ultrasonic time

由圖10可知，超聲波功率與超聲波時間的相互作用對提取迷迭香多酚的影響顯著，隨著超聲波功率與超聲波時間的提高，提取率先增后減。

2.6 驗證

設計表4來驗證響應面優化得到的提取迷迭香多酚的最佳條件的可靠性。

表4 結果驗證Table 4 Verification of results

由表4可知，實驗4的提取率最高，因此提取迷迭香多酚的最佳條件是液料比15，乙醇濃度56%，超聲波功率376 W，超聲波時間38 min。

2.7 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性結果

圖11 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性結果Fig.11 Results of antibacterial activity of Listeria monocytogene by rosemary polyphenols

由圖11可知，迷迭香多酚提取物是抑制李斯特菌的有效物質，且抑菌程度有所不同[21-23]。隨著迷迭香多酚提取物濃度逐漸提高，抑菌圈直徑逐漸增大，當濃度為200 mg/mL時，抑菌圈直徑達到最大。這可能是因為迷迭香多酚損傷李斯特菌的細胞壁和細胞膜，又或者是影響了李斯特菌的呼吸能量代謝，甚至影響了李斯特菌的DNA，進而抑制了李斯特菌的活性[24，25]。

3 結論

響應面優化提取迷迭香多酚的實驗模型和實際情況擬合度比較好，結果可用，迷迭香多酚提取的二次回歸擬合方程如下：提取率(%)=4.22—0.065A-0.10B+0.50C+0.080D-0.028AB-0.10AC-0.095AD-0.42BC+0.016BD+0.086CD-0.50A2-0.16B2-0.57C2-0.45D2(式中：A是液料比，B是乙醇濃度，C是超聲波功率，D是超聲波時間)。迷迭香多酚提取的最佳條件是液料比15，乙醇濃度56%，超聲波功率376 W，超聲波時間38 min。

迷迭香多酚能在一定程度上抑制李斯特菌的活性，且隨著迷迭香多酚的濃度提高，抑制程度增大。