圈養丹頂鶴血變原蟲的流行調查研究

賈 婷,鄭常明,丁 楠,楊明海,趙素芬,林寶慶,張顯光,羅 毅,張成林,索 勛

(1.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193;2.北京動物園圈養野生動物技術北京市重點實驗室,北京 西城 100044;3.吉林向海國家級自然保護區管理局,吉林 通榆 137215;4.黑龍江扎龍國家級自然保護區管理局,黑龍江 齊齊哈爾 161002)

鳥類血孢子蟲(Haemosporidia)包括瘧原蟲、血變原蟲、住白細胞原蟲,分布廣泛,是感染鳥類的主要病原之一,威脅圈養和野生鳥類的健康[1-3]。小型野生鳥類,尤其是雀形目野生鳥類,因可以通過簡單的網捕法捕獲,所以其血孢子蟲研究取樣相對容易[1],對于大型鳥類,特別是受保護的物種,因采樣困難導致其血孢子蟲研究非常有限,在MalAvi數據庫中可用的未鑒定物種的血孢子蟲僅約100個記錄[4]。在動物園和救護中心對鳥類的檢查提供了關于大型受保護鳥類血孢子蟲的有價值信息[5]。Scott發表了關于倫敦動物園鳥類中由血孢子蟲引起嚴重疾病的第一個信息[6],在亞洲、歐洲、南美洲、北美洲和非洲的許多動物園都報道了嚴重的血孢子蟲病[7-11]。研究表明,在動物園的鳥類中瘧疾和其他血孢子蟲存在潛在流行病學風險[10-13]。鶴(Gruiformes)被稱為濕地生態系統健康評估的“標志物種”[14]。由于大多數的鶴科鳥類都是瀕危和受保護物種[15],許多國家都建立了遷地保護項目,以保護這些鳥類的種群數量,并支持生物多樣性保護。在圈養鶴中,血孢子蟲感染的報道較少[16-18],然而這些血孢子蟲可能是成功實施遷地保護項目的障礙[12]。

據統計,在中國鶴類中血孢子蟲引起的疾病高達26.15%,尤其是幼鶴感染后影響較大,致死率較高,是造成圈養鶴大批死亡的主要疾病之一[17-18],目前,血變原蟲引起鶴類發病的研究還未見報道。本研究分別采集北京動物園、扎龍國家級自然保護區和向海國家級自然保護區等地丹頂鶴、其他水禽、昆蟲等動物的血液和蟲體樣品,采用基因測序方法,檢測樣品中血變原蟲的感染情況,分析動物和傳播媒介之間可能存在的關系,為建立珍稀鳥類疫病防控體系奠定基礎。

1 材料

1.1 樣品采集

1.1.1 采集地點 黑龍江扎龍國家級自然保護區、吉林向海國家級自然保護區、北京動物園(以下依次簡稱扎龍、向海、北京)。

1.1.2 樣品種類及數量 丹頂鶴樣品81份、水禽37種245份樣品、昆蟲3918只(見表1、表2、表3)。

1.1.3 采集時間 丹頂鶴血液、昆蟲樣品采集于2014年夏季;非丹頂鶴動物和北京動物園外鳥類樣品為近幾年積累采集。

1.2 樣品保存

1.2.1 血液樣品 新鮮血液分為3份,1份進行血涂片染色鏡檢,1份置于抗凝管-80℃保存,1份置于專用樣品保存液,備用。

1.2.2 組織樣品 對于病死鶴等動物,剖檢后立即取肝、脾、肺、腎等臟器,分為2份,1份-80℃凍存,1份置于專用樣品保存液中,備用。

1.2.3 昆蟲樣品 用捕蚊網等工具采伊蚊、庫蚊、蚋、蠓,保存于專用樣品保存液中,備用。

表1 丹頂鶴樣品采集

表2 非丹頂鶴動物樣品

表3 昆蟲樣品

2 方法

2.1 血涂片檢測 取鶴類附跖靜脈血5 μL,滴加于載玻片制備血涂片。甲醇固定,瑞氏姬姆薩染液染色30 min后,流水沖洗,風干后在光學顯微鏡下觀察。先在400×鏡頭下找到目標位置,再用1 000×油鏡目視檢測,判斷個體是否感染血孢子蟲以及寄生蟲的形態特征,判斷其所屬類群,每個血涂片觀察100個視野[1]。

2.2 DNA提取和基因測序

2.2.1 基因組DNA提取 依照TIANGEN試劑盒的使用說明書進行血液及昆蟲樣品DNA提取。

2.2.2 基因組DNA電泳檢測 取3 μL基因組DNA溶液,加入3 μL 2× Loading Buffer,充分混勻,1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,凝膠用SYBR Green 1核酸凝膠染液染色,凝膠成像儀(GDS-8000PC,GENE,美國)中觀察,主條帶清晰者進行下一步研究。

2.2.3 蚊子COI基因片段擴增與測序 為準確鑒定所采集蚊子等昆蟲的種類,選擇物種鑒定通用的條碼基因COI對昆蟲樣品進行PCR擴增[19]。所采用的引物為：C1J_1718(5′-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3′) 和 C1N_2191(5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′)。 蚊子 COI基因片段擴增體系：2×Tap酶混合溶液5 μL,引物C1J_1718、C1N_2191 各 0.2 μL,ddH2O 4 μL,模版 DNA 6 μL。蚊子COI基因片段擴增反應程序設置：Stage 1：95℃變性4 min;Stage 2：95℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸45 s(20個循環);Stage 3：95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸45 s(15個循環);Stage 4：72℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,凝膠用SYBR Green 1核酸凝膠染液染色,凝膠成像儀(GDS-8000PC,GENE,美國)中觀察。電泳檢測陽性者,配制40 μL反應體系進行PCR擴增,產物經電泳檢測后送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

2.2.4 血液寄生蟲cyt b基因片段擴增與測序 采用巢式PCR法,擴增鳥類血液寄生蟲cyt b基因片段[20]。第一輪擴增引物為HeamNF1(5′-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3′) 和 HeamNR3(5′-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3′)。 血 液 寄 生 蟲cyt b基因片段擴增第一輪的10 μL體系體系包括：2×Tap酶混合溶液 5 μL,HeamNF1、HeamNR3 各0.2 μL,ddH2O 4 μL,模版 DNA 0.6 μL。 血液寄生蟲cyt b基因片段擴增第一輪反應程序設置：Stage 1：94℃模版變性5 min;Stage 2：94℃產物變性30 s,50℃退火30 s,72℃引物延伸45 s(20個循環);Stage 3：72℃延伸10 min。第二輪擴增引物為HeamF(5′-ATGGTGTTTTAGATACTTACATT-3′) 和HeamR2(5′-CATTATCTGGATGAGATAATGGIGC-3′)。 反應體系同第一輪擴增,只是模板為第一輪擴增產物。血液寄生蟲cyt b基因片段擴增第二輪反應程序設置：Stage 1：94℃模版變性5 min;Stage 2：94℃產物變性30 s,50℃退火30 s,72℃引物延伸45 s(35個循環);Stage 3：72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測,凝膠用SYBR Green 1核酸凝膠染液染色,在凝膠成像儀(GDS-8000PC,GENE,美國)中觀察結果。電泳檢測為陽性的樣品,以第一輪擴增產物為模版,配制40 μL反應體系進行第二輪PCR擴增,產物經電泳檢測后送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。所有樣品均重復檢測3次。

2.3 測序結果分析方法 分別計算中間寄主和非鶴類鳥類血液寄生蟲的感染率;用CodonCode Aligner(Copyright,美國)對cyt b基因的雙向測序結果進行拼接,通過MalAvi數據庫(Version 2.1.1)中的Blast模塊進行序列比對,確定血液寄生蟲所屬類群[6]。DNA序列相似度達到100%的歸為相同進化支。

2.4 血液寄生蟲系統發育分析方法 選取Gen-Bank中血孢子蟲目各科屬已有序列和本研究測得的序列,共同構建系統發育樹。根據 Outlaw和Ricklefs(2014)構建的血孢子蟲目系統發育關系[21],選擇小型哺乳動物的血液寄生蟲肝囊蟲(Hepatocystis.sp)作為系統發育樹的外群。用DNASP v.5.10.1計算序列的單倍型數目(Haplotype number)等參數[22]。用jModelTest-v2.1.4進行堿基替代模型檢驗,根據貝葉斯信息標準(Bayesian Information Criterion,BIC)選擇的單倍型樹最適模型均為TN93+I+G。用BEAST v 1.8.0構建系統發育樹[23]。采用嚴格分子鐘,種群歷史動態參數選擇Yule模型,運行蒙特卡洛 -馬爾科夫鏈(Monte Carlo Markov,MCMC)5×108代,每5 000代保存一次樹。在Tracer v.1.5中檢查運行結果,ESS值均大于200,表明MCMC鏈的運行達到穩定狀態。利用TreeAnnotator v 1.7.5舍棄前2 000棵樹(burnin=2 000)后,搜索最大分支置信樹(Maximum Clade Credibility Tree,MCC Tree)。用FigTree v1.4.2打開所獲得的MCC樹,進行分析。

3 結果

3.1 丹頂鶴血變原蟲的形態學特征 向海、扎龍自然保護區血涂片觀察到多只丹頂鶴感染血變原蟲,形態特征如下(見中插彩版圖1)：血變原蟲配子體寄生在宿主細胞質中,沿著受感染的紅細胞細胞核生長,并且明顯使宿主細胞核移位。未成熟配子體形態多不規則,日益增長的配子體通常不觸及紅細胞的核,因此,它會產生或多或少不太明顯的未填充空間,如配子體與宿主紅細胞核之間的一個“裂隙”(見中插彩版圖1,A、B、D),這種“裂縫”在完全發育的配子體中消失(見中插彩版圖1,C、E、F)。成熟配子體的外圍邊緣平滑,與紅細胞的細胞膜緊密相靠,包裹紅細胞細胞核生長,但不完全包裹,留有大約細胞核長度的空隙(見中插彩版圖1,F)。大配子(見中插彩版圖1,A、B、C)體原生質顆粒狀,粗糙、藍染,核紅染,胞漿中有時會包含一些小液泡,色素顆粒隨機分散在細胞質中,呈現圓形或橢圓形,平均直徑大小為0.5～1.0 μm。 小配子體(中插彩版圖 1,D、E、F)細胞質均勻,胞漿以及胞核染色均較大配子體染色淺。

3.2 丹頂鶴血變原蟲的感染情況 在81份丹頂鶴樣品中,血變原蟲檢出率為19.75%,共檢測出兩個血變原蟲 Haemoproteus antigonis(hGRUJAP01)和Haemoproteus sp.(hGRUJAP02)進化支,其中hGRUJAP01檢出15份,占檢出樣品的93.75%(15/16);hGRUJAP01與已知血變原蟲序列GRUAME01相似性達100%,見表4。

3.3 非丹頂鶴鳥類(水鳥)血變原蟲的感染情況在鴻雁等37種動物245份樣品中,鵜鶘(Pelecanus rufescens)的樣品中檢出1個血變原蟲hPELRUF01進化支,陽性率為0.41%,詳見表4。

3.4 昆蟲攜帶的血變原蟲的情況 為了便于操作,把4種3 918只昆蟲樣品分成190份進行檢測,其中2份檢出血變原蟲,陽性率為1.05%,在扎龍和向海的里海伊蚊(Ochlerotatus caspius)中都檢出血變原蟲(hOCHCAS01)進化支。蚊子中所檢測出的血變原蟲hOCHCAS01進化支與向海和扎龍丹頂鶴中所檢測出的進化支hGRUJAP01和hGRUJAP02為近緣類群,見表4。

表4 丹頂鶴、水鳥、昆蟲樣品中血變原蟲檢查結果

3.5 感染血變原蟲的系統進化關系分析 對丹頂鶴、鵜鶘、里海伊蚊中檢出的血變原蟲進行系統進化關系分析(圖2)。本研究根據比對結果共定義了4個單倍型,形成了1個血變原蟲屬單系群。扎龍、向海的丹頂鶴單倍型hGRUJAP01,hGRUJAP02與北京動物園鵜鶘的血變原蟲單倍型hPELRUF01以及扎龍、向海環境里海伊蚊中檢測到的血變原蟲單倍型hOCHCAS01與同一個血變原蟲進化支(GRUAME01)近緣,而與其他已報道的鳥類血變原蟲系統進化關系較遠。

4 討論

有關鶴科鳥類感染血孢子蟲的研究報道較少,僅有兩種血變原蟲(H.antigonis和H.balearicae)和一種住白細胞原蟲(L.grusi)感染鶴科鳥類的報道[1]。

血變原蟲 H.antigonis最早的報道始于印度[21],目前尚未有我國丹頂鶴、鵜鶘和里海伊蚊中血變原蟲的cyt b基因序列報道,本研究發現的鶴科鳥類感染H.antigonis在中國尚屬首次報道。我們在丹頂鶴的血涂片中發現大量的血變原蟲紅內期配子體,與已報道的H.antigonis配子體形態相吻合[21]。本研究報道的血變原蟲cyt b DNA序列(445 bp,GenBank登陸號MG980617)與在美國發現的鶴的血變原蟲序列(616 bp,GenBank登陸號KX223873.1)[22]相吻合,因此我們推測本研究發現的血孢子蟲屬于H.antigonis。在幼鶴和成鶴中均發現有H.antigonis感染,表明在當地發生了血變原蟲傳播,幼鳥的血變原蟲感染可能來源于親鶴。

圖2 感染血變原蟲的系統進化關系分析

基于cytb基因序列的系統進化關系分析表明,在丹頂鶴、鵜鶘、里海伊蚊樣品中發現的血變原蟲的系統進化關系較近,并形成一個相對獨立的單系群,這個單系群與其他已報道的鳥類血變原蟲的系統進化關系較遠。Darriba等(2012)報道血變原蟲的傳播媒介為虱蠅,本研究與其流行地域不同,我們推測系統進化關系較遠的原因可能為H.antigonis可以通過與其他血變原蟲傳播媒介不同的雙翅目昆蟲媒介進行傳播,但這一假設需要進一步的現場觀察和實驗研究來驗證。

本研究發現在81份丹頂鶴樣品中,血變原蟲檢出率為19.75%,雖然丹頂鶴等鳥類動物中血變原蟲的感染率較高,但是感染血變原蟲的發病率很低。所以我們不能確定目前檢測出的血變原蟲對丹頂鶴及相關動物潛在的致病作用。因此,我們要加強對珍稀鳥類中血變原蟲以及其他血孢子蟲的監測。

研究發現,在扎龍、向海的丹頂鶴,扎龍、向海的里海伊蚊,北京的鵜鶘樣品中檢測中相同的血變原蟲進化支(GRUAME01),并且該進化支是感染率最高的進化支,并與向海丹頂鶴檢出的血變原蟲(BAFLA02)相似。伊蚊不是血變原蟲傳播的媒介,血變原蟲能否在伊蚊體內完成生活史,伊蚊能否傳播血變原蟲,還有待進一步研究。但是在伊蚊中檢測到血變原蟲,也進一步證實環境中有血變原蟲流行情況,我們推斷是伊蚊叮咬了感染血變原蟲的圈養鶴類或者其他鳥類而攜帶帶有血變原蟲的血液,進而被檢測出。

綜上,疫病監測是做好疫病防控的重要手段,特別是動物園、保護區的圈養動物與保護區瀕危野生動物之間由于傳播媒介的聯系存在著密切的關系,因此要加強單位和部門之間的協同意識,建立疫病防控體系,對野生動物及生態保護有積極的意義。