大鯢脾臟結節癥病原菌的分離鑒定及藥敏試驗

趙光偉,沙 莎,黎學練,程 潔,楊芙蓉,趙長潤,吳 青

(1.西南大學動物科學學院,重慶 榮昌 402460;2.重慶市開州區水產技術推廣站,重慶 開州 405499)

中國大鯢(Andrias davidianus),是世界上現存最大的兩棲動物[1]。近年來,我國大鯢人工養殖業發展十分迅速,但隨著大鯢養殖業的發展,病害問題日趨嚴重,嚴重阻礙了大鯢人工養殖的健康發展[1]。在報道的養殖大鯢細菌性疾病病原體中,雖然涉及假單胞菌屬、檸檬酸菌屬、愛德華菌屬和摩爾摩根氏菌屬等的細菌病原體[2];但仍以氣單胞菌屬家族中多種細菌感染引起大鯢細菌性疾病研究居多,如孟彥等[3]、鐘蕾等[4]從患腹水病、敗血癥病大鯢鑒定出嗜水氣單胞菌;王印等[5]從患腐皮病的大鯢皮膚病灶分離到了殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種;王旭等[6]從暴發腐皮病大鯢中分離鑒定了維氏氣單胞菌。綜上所述,氣單胞菌屬細菌是目前危害大鯢養殖的重要病原菌。

2017年9月,重慶某養殖基地的大鯢相繼發生以脾臟出現“結節”為主要特征的病例,該病呈小面積暴發和流行,病程一般為1～7d。患病大鯢表現為皮膚出現白斑、潰瘍、體紅、脹氣、腹水、肢體腐爛等體表癥狀,最終死亡。剖檢可見肝臟或腫大或褐色蒼白,質脆,多數在脾臟表面有乳白色不規則斑紋或數個灰白色直徑為1～3 mm不等的“結節”病變。該病在2015-2018年間在我國重慶、陜西、貴州等省份均有發生,給大鯢養殖企業帶來巨大的經濟損失。本研究對患病大鯢進行了病原菌的鑒定及藥敏試驗,以期為防控該病提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 發病大鯢：來自重慶開州某大鯢人工養殖場,患病大鯢體長約50 cm,體表無明顯病變,剖檢發現肝臟灰黃色、質脆,脾臟整個表面呈云霧狀,可見1～3 mm大小的乳白色結節或斑紋等典型病變(見中插彩版圖1A、B)。健康大鯢：20尾,體重100～200 g,購自陜西漢中紅星大鯢養殖場(非疫源地)。健康鯽魚：60尾,長約15 cm,購自重慶市榮昌區某良種魚場。

1.2 主要試劑 藥敏紙片(批號20150924)、O/129試紙片(批號20150620)、克氏雙糖(批號20150908),購自杭州生物技術有限公司;BIOFOSUN-GN鑒定板(批號20150630),購自上海星佰生物技術有限公司;細菌總基因組提取試劑盒GenElute Bacterial Genomic DNA kit,購自Sigma公司;PCR擴增試劑盒PCR Core System II,購自Promag公司。

1.3 病理組織切片觀察 無菌采集臨床患病大鯢的肝臟和脾臟組織,用10%中性福爾馬林溶液固定,經石蠟包埋、切片和H.E.染色,光學顯微鏡下觀察患病大鯢的組織病變。

1.4 細菌分離 無菌條件下取患病大鯢肝臟、脾臟和腎臟組織于LB培養基上劃線分離,25℃恒溫培養2～5 d后進行菌落觀察、進而純化并編號(KNL-1…n),4℃保存備用。

1.5 致病性試驗

1.5.1 鯽魚致病性試驗 取暫養一周健康鯽60尾隨機分組,按分離的菌株數分為5個試驗組和1個對照組,每組10尾,分離菌每尾腹腔接種0.2 mL(3.0×108CFU/mL)鯽,對照組注射無菌生理鹽水,觀察記錄試驗結果,對死亡鯽進行細菌的分離和鑒定[4]。

1.5.2 大鯢感染試驗 取能致鯽死亡且死亡率高的分離菌接種大鯢。取非疫源地健康大鯢20尾隨機分為試驗組和對照組,每組10尾。調整致病菌株濃度為6.0×108CFU/mL,試驗組每尾腹腔接種2 mL,對照組注射等量無菌生理鹽水,觀察記錄大鯢臨床表現,死亡大鯢進行細菌的分離和鑒定。

1.6 16S rDNA基因序列測定 16S rDNA基因引物序列為：F-5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(451-473 bp);R-5′-GGTTACCT TGTTATGACTT-3′(1 115 ～1 135 bp),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

提取分離菌總DNA作為模板。PCR反應體系(50 μL)為：模板 DNA 4.0 μL;Premix Taq 25.0 μL;上下游引物(10 pmol/ μL)各 2.0 μL;ddH2O 17.0 μL。PCR反應條件為94℃預變性5 min,94℃變性30 s,55℃復性30 s,72℃延伸5 min,30個循環;72℃終末延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析,并利用DNAStar軟件進行同源性比對。

1.7 細菌生化鑒定 將分離純化致病菌株進行革蘭染色鏡檢其形態,分別接種于麥康凱培養基、TCBS培養基、克氏雙糖斜面培養基進行培養特性觀察。按BIOFOSUN細菌鑒定系統要求,將待鑒定致病菌接種于BIOFOSUN-GN48鑒定板,22℃恒溫孵育,于24 h和48 h用BIOFOSUN微生物鑒定分析系統解讀分析結果。

1.8 藥敏試驗 用紙片擴散試驗方法,選擇16種藥敏紙片進行藥敏試驗,通過測量抑菌圈的大小對試驗結果進行分析。判定標準參照CLSI抗菌藥物敏感性試驗。

2 結果與分析

2.1 病理切片觀察結果 病理切片發現臨床患病大鯢脾組織有出血,淋巴細胞溶解,有大量絲網狀纖維素分布,表現為纖維素性壞死性脾炎(見中插彩版圖2A);肝細胞主要表現為腫脹、變性(見中插彩版圖2B)。

2.2 分離菌對鯽魚致病性 將患病大鯢組織中的分離菌(共5株),編號為：KNL1-5,分別腹腔接種于健康鯽魚。發現5株菌對鯽魚的致死率分別為100%,0%,40%,0%和40%,對照組無死亡。其中KNL1菌的致病力最強,試驗鯽魚在48 h內發病死亡,病死鯽魚體表出血,胸腹鰭出血嚴重,剖檢見肝胰臟出血,有少量血性腹水,對試驗死亡鯽魚進行分離培養,均能分離到接種菌。由此可見KNL1菌對鯽魚的致病力最強,將其作為大鯢回歸感染試驗的受試菌。

2.3 KNL1對大鯢的致病性 KNL1菌接種大鯢12 h后發生浮頭頻繁,腹部向上翻擺,18 h時第1尾死亡,36 h時死亡兩尾,其余7尾在48～60 h間全部死亡,對照組大鯢均健康存活。剖檢死亡大鯢,可見大量腹水,肝臟灰褐色腫大,脾臟可見不規則的乳白色斑紋或結節,與臨床自然發病病例癥狀一致,說明KNL1菌是導致大鯢結節癥的病原菌。

2.4 KNL1菌的分子生物學鑒定結果 PCR產物測序結果經NCBI Blast分析對比,發現KNL1菌與GeneBank中KU570345和KU570316(Aeromonas sulmonicida)的序列同源性達到100%,同源性分析如圖3所示。通過16SrDNA序列鑒定,KNL1菌為殺鮭氣單胞菌(Aeromonas sulmonicida)。

圖3 NKL1 16S rDNA同源性比較結果

2.5 KNL1的生化鑒定結果 通過形態特征、培養特性及生化特性試驗,KNL1為革蘭陰性短桿菌,在LB培養基生長良好,菌落灰白圓形約1～3mm,表面光滑,麥康凱培養基生長,克氏雙糖為K/A,TCBS培養基不生長,β溶血,氧化酶陽性,耐O129,耐氨芐西林,無運動性。利用BIOFOSUN-GN48鑒定反應板,系統自動判定結果及參數為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種,概率98%,相似指數0.970,距離指數0.015。綜合該菌形態學、培養特性、分子生物學和生化鑒定結果,KNL1確定為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種(A.salmonicida ssp.masoucida)。

2.6 藥敏試驗結果 16種抗生素藥敏紙片對KNL1菌進行藥敏試驗,結果如表1所示。其中該菌對頭孢氨芐、卡那霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、先鋒霉素、新霉素、慶大霉素、左氧氟沙星、米諾環素、丁胺卡那霉素和氟苯尼考高度敏感;對氨芐西林、麥迪霉素和羥芐西林耐藥。

3 討論

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas sulmonicida)屬于弧菌科,氣單胞菌屬,殺鮭氣單胞菌種[7]。早期文獻記載殺鮭氣單胞菌主要是侵害冷水魚,如鮭鱒魚類引起癤瘡病和潰爛病[8-9],隨后陸續有殺鮭氣單胞菌感染鮭鱒鮭以外的水生動物及陸生動物的報道,如：王雪慧等[10]報道殺鮭氣單胞菌引起點帶石斑魚潰爛病,王海娟[11]報道了殺鮭氣單胞菌引起鯉魚死亡,劉寧等[12]報道細鱗鮭感染殺鮭氣單胞菌引起死亡,周冬仁等[13]報道殺鮭氣單胞菌可引起烏鱧死亡,林如濤等[14]報道從重慶地區山羊血液發現殺鮭氣單胞菌。盡管有大量資料證明殺鮭氣單胞菌能夠引起多種動物的感染,然而本研究中殺鮭氣單胞菌感染大鯢并造成其發病的報道在國內外尚數首次,這進一步豐富了殺鮭氣單胞菌的感染譜。以往報道的水生動物感染殺鮭氣單胞菌后其臨床癥狀主要表現為皮膚潰爛、癤瘡、敗血癥等,而本研究中大鯢感染該菌后主要表現為脾臟的壞死結節,這一典型的臨床表現在其他資料中均未見有報道,因此該研究對大鯢臨床疾病的快速診斷具有一定的指導意義。

表1 KNL1藥敏試驗結果_

在鑒定KNL1菌時,本研究采用16S rDNA基因序列分析與生化試驗相結合的方式。眾所周知,16S rDNA基因序列分析是國際公認的一種鑒定方法[,15],然而鑒定過程中僅依靠序列分析結果只能將該菌鑒定為殺鮭氣單胞菌,由于殺鮭氣單胞菌有4個亞種,即殺鮭亞種、無色亞種、殺日本鮭亞種、史氏亞種[16],根據測序結果不能進一步確定該菌屬于哪一亞種。本研究進一步利用BioFosun-GN系統代謝指紋法將其最終確定為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭氣單胞亞種。

在研究KNL1對鯽魚的致病力中,接種后可導致健康鯽魚100%死亡,臨床表現為腹鰭部體表發紅,出血,體表鱗片脫落,泄殖孔充血,剖檢可見肝胰臟有淤血、出血,有較多腹水,這與王海娟[11]報道的鯉魚感染殺鮭氣單孢菌癥狀類似。由于大鯢種群數量稀少,野生大鯢為國家二級保護動物,在研究其病原菌的致病性時首先利用鯽魚確定分離菌株的致病性再回歸感染大鯢,這種方法能夠大大減少試驗大鯢的數量,與試驗動物的“3R”原則(替代、減少、優化)一致,在大鯢的疾病研究中具有重要意義。

前期的研究資料表明,大鯢的免疫系統較魚類更為發達,非特異性免疫和特異性免疫都較完善[17],因此自然狀態下健康大鯢對疾病具有較強的抵抗能力,能造成該病在重慶某養殖場暴發,一方面與病原菌殺鮭氣單孢菌、殺日本鮭氣單胞亞種具有較強的致病力有關,另一方面也跟該場大鯢養殖密度大或其他原因如外傷、餌料等導致大鯢機體抵抗力下降有關,因此,在大鯢的人工養殖過程中,加強飼養管理是非常必要的。本研究最終確診了造成養殖大鯢結節癥的病原是殺鮭氣單孢菌、殺日本鮭氣單胞亞種,然而該病的致病機理尚待進一步研究。

KNL1的藥敏試驗結果顯示,該菌僅對羧芐西林、麥迪霉素,氨芐西林耐藥;對其他試驗的13種抗生素均敏感,這與王高學等[18]報道的白斑狗魚殺鮭氣單胞菌史氏亞種,楊嘉龍等[19]報道的養殖刺參殺鮭氣單胞菌、殺日本鮭亞種,王海娟等[11]報道的鯉魚殺鮭氣單胞菌、殺鮭亞種的藥敏試驗結果基本一致,殺鮭氣單胞菌的耐藥譜變化不顯著,這可能與養殖場的用藥習慣有一定關系,或與殺鮭氣單胞菌亞種較少感染除鮭鱒魚以外的水生動物有關。這一結果對臨床大鯢結節癥的防控具有一定的指導價值。