雞新城疫(基因Ⅶ型)、禽流感(H9亞型)二聯滅活疫苗(aSG10株+G株)在蛋雞上的安全性及免疫效果研究

劉長清,黃秀英,李成山,岳豐雄,丁 莉,邢 剛

(1.北京市華都峪口禽業有限責任公司,北京 平谷 101206;2.成都天邦生物制品有限公司,四川 成都 610100)

新城疫(ND)是由雞新城疫病毒(NDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染性疾病,給世界各國的養禽業造成了巨大損失[1]。分子流行病學調查結果顯示,近年來我國新城疫流行毒株以基因Ⅶ型為主,與我國目前廣泛使用的疫苗株LaSota和Clone 30(均屬于基因Ⅱ型)等存在明顯差異,雖然雞群在整個飼養期內進行過多次常規疫苗免疫,但仍有感染強毒株引起流行的可能性,臨床上主要表現為非典型性新城疫的發生[2-6]。因此開發免疫原性更好、與目前流行株更匹配的疫苗已成為新城疫疫苗研發的趨勢和當務之急。中國農業大學對分離到的基因 VII型毒株 Chicken/Shandong/SG10/2010株(簡稱SG10株)進行基因工程操作,成功獲得1株致弱株aSG10株,該毒株具有良好的安全性和免疫原性[6]。

H9亞型禽流感自1994年我國首次報道后,廣泛流行于多個省份,盡管采取多種措施,但該病仍對養禽業造成了巨大損失[1]。分子流行病學調查結果顯示,近年分離株與早期疫苗株HA基因遺傳進化距離不斷加大,同源性不斷降低,現有疫苗對流行株的保護力逐漸下降,疫苗株應當進行更新[4-5,7]。中國農業大學通過對大量分離株進行試驗,篩選得到一株免疫原性較好的毒株：A/chicken/Hebei/G/2012(H9N2)株(簡稱G株)。

本試驗對雞新城疫(基因Ⅶ型)、禽流感(H9亞型)二聯滅活疫苗(aSG10株+G株)(簡稱“二聯苗”)對蛋雞的安全性、免疫效力和免疫持續期進行評價,對二聯苗試驗數據進行完善,對蛋雞合理使用該疫苗提供科學依據。

1 材料

1.1 試驗疫苗 雞新城疫(基因Ⅶ型)、禽流感(H9亞型)二聯滅活疫苗(aSG10株+G株)中間試制產品,由成都天邦生物制品有限公司滅活疫苗GMP車間胚毒滅活疫苗生產線試制生產,批號為試201502。

1.2 試驗雞 京紅1號蛋雞,為北京市華都峪口禽業有限責任公司飼養。

1.3 HI抗原及攻毒用毒株 NDV aSG10株和H9亞型AIV G株HI抗原,NDV強毒株SG10株和H9亞型AIV G株,均由中國農業大學制備、提供。

1.4 隔離器 雞飼養隔離器,取得北京市實驗動物使用許可證,由中國農業大學提供。

2 方法

2.1 安全性試驗 進行單劑量、超劑量免疫安全性試驗。

2.1.1 單劑量免疫安全性試驗 取115日齡京紅1號蛋雞400只,隨機分為2組,200只/組,分別以頸部皮下和腿部肌肉免疫二聯苗,0.5 mL/只,另取100只不免疫作為空白對照,免疫后每日觀察試驗雞的臨床癥狀。統計免疫后28 d和56 d蛋雞的產蛋情況,并于免疫后28 d,每組隨機剖檢20只,觀察注射部位疫苗的吸收、殘留情況和是否存在炎性反應。

2.1.2 超劑量免疫安全性試驗 取115日齡京紅1號蛋雞400只,隨機分為2組,200只/組,分別以頸部皮下和腿部肌肉免疫二聯苗,1.0 mL/只,另取100只不免疫作為空白對照,免疫后每日觀察試驗雞的臨床癥狀,統計免疫后28 d和56 d蛋雞的產蛋情況,并于免疫后28 d,每組隨機剖檢20只,觀察注射部位疫苗的吸收、殘留情況和是否存在炎性反應。

2.2 免疫效力試驗

2.2.1 免疫及分組 取115日齡京紅1號蛋雞5 000只,經頸部皮下途徑免疫二聯苗,0.5 mL/只,同時取100只不免疫作為對照雞。

2.2.2 抗體檢測 分別于免疫前、免疫后2周、4周、6周、8周、10周、3個月、4個月、5個月、6個月進行采血,每次分別從免疫試驗組和空白對照組隨機抽取30只雞和10只雞,進行采血、分離血清,分別測定NDV和H9亞型AIV的HI抗體。

2.2.3 攻毒試驗 分別于免疫后21日齡和免疫后6個月,從試驗雞中隨機抽取40只免疫雞和10只對照雞,免疫試驗組隨機分為2組,20只/組,分別進行新城疫攻毒保護試驗和禽流感(H9亞型)攻毒保護試驗,同日齡對照雞各5只作為攻毒空白對照組。

2.2.3.1 新城疫攻毒試驗 免疫雞20只連同對照雞5只,每只雞各肌肉注射NDV SG10株0.2 mL(含105.0ELD50),攻毒后觀察14 d,記錄雞只發病和死亡情況。攻毒后5 d采集泄殖腔拭子進行病毒分離,對病毒分離陰性的樣品,應盲傳1次后再進行判定,以免疫攻毒雞不發病、不死亡且病毒分離陰性判為保護,免疫組應至少70%保護。

2.2.3.2 禽流感(H9亞型)攻毒保護試驗 免疫雞20只連同對照雞5只,每只雞各靜脈注射H9亞型AIV G株0.2 mL(含106.0EID50),攻毒后5 d采集每只雞咽喉拭子利用雞胚法進行病毒分離,對病毒分離陰性的樣品,應盲傳1次后再進行判定,以試驗雞病毒分離陰性判為保護,免疫組應至少90%保護。

3 結果

3.1 安全性試驗

3.1.1 單劑量免疫安全試驗 二聯苗經頸部皮下注射和肌肉注射途徑單劑量接種115日齡蛋雞,接種后觀察56 d,試驗雞全部健活,采食、飲水、精神均正常,未見任何不良反應。免疫后28 d剖檢可見接種部位無炎癥、無結節、疫苗吸收良好。免疫后28 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為27.0%和27.3%,空白對照組為27.2%,各組均無顯著差異;免疫后56 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為93.4%和93.6%,空白對照組為93.7%,各組均無顯著差 異,結果見表1。

表1 單劑量接種對蛋雞的安全試驗

3.1.2 超劑量接種安全試驗 二聯苗經頸部皮下注射和肌肉注射途徑超劑量接種115日齡蛋雞,接種后觀察56 d,試驗雞全部健活,采食、飲水、精神均正常,未見任何不良反應。免疫后28 d剖檢顯示,經2種途徑接種疫苗后,均吸收良好,注射部位無明顯炎癥反應和結節(見中插彩版圖1)。免疫后28 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為27.5%和27.8%,空白對照組為27.4%,各組均無顯著差異;免疫后56 d,腿部肌肉和頸部皮下免疫組產蛋率分別為94.1%和93.7%,空白對照組為93.8%,各組均無顯著差異,結果見表2。

表2 超劑量接種對蛋雞的安全試驗

3.2 免疫效力試驗

3.2.1 抗體檢測 免疫前,雞群NDV HI抗體平均滴度為8.1 log2,免疫后2周,HI抗體平均效價為10.9 log2,免疫后4周 HI抗體滴度達到高峰為11.0 log2,至免疫后6月,NDV HI抗體平均效價不低于6.0 log2;免疫前雞群H9 HI抗體平均滴度為10.3 log2,免疫后2周,HI抗體平均效價為9.1 log2,至免疫后6月,HI抗體平均效價均不低于7.0 log2。空白對照組雞群不論是NDV HI抗體還是H9 HI抗體均一直下降,至免疫后6個月分別下降至1.9 log2和3.9 log2。結果見表3和圖2。

3.2.2 攻毒試驗 免疫后21日及免疫后6個月,對免疫雞進行攻毒,NDV和H9免疫攻毒組存活率達20/20,保護率均在90%以上。不免疫對照雞在免疫后21日,對NDV的攻毒保護為5/5,對H9亞 型AIV的攻毒保護為5/5,但在免疫后6個月,對NDV的攻毒保護率為3/5;對H9亞型AIV保護率為1/5。結果見表4。

表3 蛋雞免疫后HI抗體消長情況

圖2 蛋雞免疫受試疫苗(試201502)后ND(A)和H9(B)抗體消長情況

4 討論

新城疫與H9亞型禽流感是危害我國禽業的兩大疾病,對養禽業可造成巨大經濟損失。對于新城疫,雖然不同基因型疫苗均能保護SPF雞抵抗基因Ⅶ型強毒株的致死性攻擊,但基因Ⅶ型新城疫疫苗能顯著降低免疫雞強毒感染后的排毒率和排毒量,在臨床上可有效控制免疫雞群中非典型新城疫的發生[2,8]。中國農業大學多年來對H9亞型禽流感的疫情動態進行跟蹤調查,積累了大量臨床分離株,通過交叉免疫保護試驗篩選出一株免疫原性較好的病毒株G株,前期試驗結果表明,該毒株對不同時期流行毒株均有較好的保護作用,可用于滅活疫苗的研制[9]。

本試驗使用新城疫基因Ⅶ型人工致弱毒株aSG10株及H9亞型禽流感流行毒株G株,制備的二聯疫苗,在蛋雞上進行了安全性和效力研究。安全性試驗結果表明,二聯苗經皮下或肌肉途徑單劑量、超劑量接種蛋雞后,未對雞群造成明顯的全身和局部不良反應,雞群產蛋率均與對照無明顯差異,說明該疫苗具有良好的安全性。

表4 免疫后不同時間攻毒保護結果

HI抗體水平的高低是評估疫苗保護效果的一個重要因素。在實際生產中,常用血清學方法替代免疫攻毒法來衡量疫苗接種后的免疫力。通常認為疫苗免疫后雞群特異性抗體水平越高,雞群抵抗相應病毒感染的能力越強。蛋雞常規免疫程序中,小日齡時需免疫新城疫及H9亞型禽流感相關疫苗,產蛋前(110～130日齡)加強免疫1次,因本試驗效力研究是在產蛋前進行,空白對照組因小日齡時進行過相關疫苗免疫,仍有一定抗體滴度,但試驗雞在免疫二聯苗后抗體明顯提高,且免后6個月仍保持在保護水平(ND-HI抗體≥6.0 log2,H9-HI抗體≥7.0 log2)以上,而空白對照組則持續下降。攻毒保護試驗顯示,免后6個月新城疫攻毒保護率為100%,禽流感攻毒保護率為90%。表明該二聯苗的免疫效果良好,免疫持續期長。