5種復合藏藥對西藏牦牛源大腸桿菌抗菌活性的研究

趙燕娟,王 剛,參木友,索朗斯珠

(1.西藏農牧學院動物科學學院 西藏高原動物疫病研究自治區高校重點實驗室,西藏 林芝 860000;2.西藏農牧科學院草業研究所,西藏 拉薩 850000)

近年來由于抗生素的不合理使用,導致耐藥菌株引發的臨床感染現象日趨嚴峻,使得現有抗菌藥物對臨床耐藥菌株的療效顯著降低甚至無效,尤其對危重癥感染患者構成嚴重威脅,目前耐藥菌感染已經成為臨床治療的棘手問題[1]。牦牛大腸桿菌病是由大腸埃希菌所導致的,只有在牦牛中發生,零星或地方性流行。每年春夏季發生,春末夏初是發病高峰期。最早發生在母牦牛,牦牛在哺乳期最容易感染,其次是1～4月齡的犢牛有易感性,公牦牛不容易感染牦牛大腸桿菌病。陳明勇報道,致病性大腸桿菌是牦牛腹瀉的主要病因[2],該報告與其他學者一致[3-4]。病牛及受污染的牦牛是感染的主要來源,它們在牧場和水源的糞便通過消化道污染健康牛群,導致健康牦牛也會感染牦牛大腸桿菌病。牦牛大腸桿菌病在西藏牧區流行較為普遍,嚴重影響牦牛健康和牦牛產業的發展[5];大腸桿菌已經被確定為耐藥性檢測的指示菌株,對其耐藥性的監測有重要意義[6]。我國傳統醫藥治療感染性疾病有著悠久的歷史,而且藥材資源非常豐富,從中尋找開發新型抗菌藥物已成為國內外研究的焦點[7-8]。對現代中藥的藥理研究表明：清熱解毒類藥能夠抗菌,抗病毒,抗癌。有較廣的抗菌譜,能抑制病毒,提高機體非特異性免疫力,對腫瘤細胞有抑制作用,具有消炎、止痛、殺菌、抑癌、排毒和退熱等作用[9]。藏藥生境獨特,藥理功效強,其臨床療效引起國內外的關注和日益重視[10],目前對藏藥的藥理研究報道較少,對清熱解毒復方的體外抑菌作用基本沒有研究報道,為了探討藏藥石榴健胃丸、仁青芒覺、十五味黑藥丸等5種復合藏藥發揮藥理作用的機理,闡明該藥治療胃腸疾病的作用機制以充分開發其藥物利用價值,為民族醫藥藏藥研究開發提供基礎,我們進行了石榴健胃丸、仁青芒覺、十五味黑藥丸等5種復合藏藥體外抗菌試驗研究。

本試驗選取五種復合藏藥進行體外抑菌試驗,通過比較,他們對14株腸出血性大腸桿菌的抑菌效果,旨在篩選出治療腸出血性大腸桿菌病的有效的藏藥。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株來源 14株西藏牦牛源腸出血性大腸桿菌均為實驗室保存菌株;質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922,購自中國獸醫藥品監驗所。

1.2 藏藥來源 石榴健胃丸、仁青芒覺、十五味黑藥丸、仁青常覺、仁青二十五味馬寶丸等5種藏藥,購自西藏自治區林芝市健民大藥房。

1.3 常用抗生素藥敏片 氯霉素、諾氟沙星、萬古霉素等14種抗生素,均購自北京天壇藥物生物技術開發公司。

1.4 實驗動物 昆明種小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,體重無顯著性差異。

1.5 培養基 普通肉湯培養基、普通瓊脂培養基,購自北京陸橋生物技術有限責任公司。

1.6 儀器 隔水式電熱恒溫培養箱、DZF-6021型真空干燥箱,均購自北京市六一儀器廠;AB204-N型電子分析天平,購自上海醫用核子儀器有限公司;SW-CJ-JC超凈工作臺,購自蘇州凈化設備公司;CHA-S型往復空氣恒溫搖床,購自常州金壇良友儀器有限公司。

1.7 方法

1.7.1 復壯 14株出血性大腸桿菌菌株：將大腸桿菌菌株接種于裝有LB肉湯的50 mL三角瓶,溫度設為37℃,搖床搖速為120 r/min,培養12～24 h。

1.7.2 藏藥的提取、分離 根據藏藥的特殊性,分別采用以下方法制備。

1.7.2.1 研磨法 將五種藏藥藥丸充分研碎后備用。

1.7.2.2 高壓滅菌法 將研碎烘干后的五種復合藏藥藥丸按50 g加水500 mL的比例煎煮,將濾液濾出,再將濾渣加水至200 mL,二次煎煮,后將兩次煎煮所得濾液加在一起,水溶液濃縮至50 mL,用容量瓶定容,裝瓶后高壓滅菌取出,放涼備用。所得復合藏藥水煎劑的濃度為1 g/mL[9]。

1.7.3 自制藏藥藥敏片 用打孔器打成直徑為5 mm的圓片,每14片放入小瓶中高壓滅菌30 min,烘干備用。取適量配制好的復合藏藥水煎劑放入小瓶內(藥液的多少以最透紙片為宜),浸泡24 h后,將多余的藏藥水煎劑倒掉并烘干,而后加蓋置4℃的冰箱中保存備用[11]。

1.7.4 藥敏試驗 將復壯成功的14株大腸桿菌用移液槍各吸取1 000 μL置于營養瓊脂培養基中,并用涂菌棒涂抹均勻,標號。將烘干的5種復合藏藥藥敏紙片和購買的14種抗生素藥敏紙片按區域分別貼于培養基中,倒置放于37℃恒溫箱中培養24 h后觀察。藥敏試驗按照CLSI(Clinical and laboratory standards Intermediate)推薦的K-B法進行。抑菌結果的判定參照NCCLS(2013)公布的標準以敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐藥 (Resistant)3種形式對抑菌圈大小作出判定[12]。

1.7.5 動物試驗 將復壯成功的14株大腸桿菌用滅菌生理鹽水調整為含菌量為109CFU/mL的懸浮液,作為攻毒用菌液,其中一組分別以0.2 mL/只腹腔接種小鼠5只,同時以相同劑量的滅菌營養肉湯按相同途徑接種小鼠1只,作為空白對照;另一組分別以0.2 mL/只腹腔接種小鼠5只,并以相同劑量的仁青芒覺按相同途徑接種這5只小鼠,接種后隔離飼養,觀察5 d,觀察小鼠的死亡情況。如果發現有病死或發病小鼠,取其腸管、腎臟進行細菌分離鑒定,其培養特性、菌落形態、血清學鑒定,觀察這些臟器內是否還有符合攻毒原菌株的大腸桿菌。

2 結果與分析

2.1 藏藥藥敏紙片抑菌法結果 經培養24 h后,取出觀察,測量其抑菌圈包括藥敏紙片的直徑,用cm表示,判斷標準：直徑大于1.5～2.0 cm為強抑菌,用“+++”表示;1.0～1.4 cm為抑菌,用“++”表示;0.9 cm以下為弱或不完全抑菌,用“-”表示。由表中數據可以得知,14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對5種復合藏藥的藥敏檢測結果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對仁青芒覺表現為中度敏感;對石榴健胃丸、十五味黑藥丸、仁青二十五味馬寶丸、仁青芒覺均表現為耐藥,其中對石榴健胃丸耐藥的有9株,耐藥率64.29%;其對仁青芒覺的有3株,耐藥率21.43%;中對十五味黑藥丸耐藥的有8株,耐藥率57.14%;對仁青常覺的有10株,耐藥率71.43%;對仁青二十五味馬寶丸耐藥的有9株,耐藥率64.29%。14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對14種常用抗生素的藥敏檢測結果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對萬古霉素、青霉素、紅霉素表現為耐藥;對呋喃妥因表現為中度敏感;對氯霉素、諾氟沙星、萬古霉素、頭孢唑啉等10種抗生素均表現為敏感(表 1、表 2、表3、圖1)。

表1 5種藏藥藥敏片法抑菌結果

表2 常用的14種抗生素的藥敏片法抑菌結果

CHL：氯霉素;NOR：諾氟沙星;VAN：萬古霉素;CFZ：頭孢唑啉;STR：鏈霉素;PEN：青霉素;AMK：丁胺卡那霉素;TCY：四環素;AZM：阿奇霉素;SXT：復方新諾明;ERY：紅霉素;NIT：呋喃妥因;GEN：慶大霉素;FOX：頭孢西丁

表3 14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對五種藏藥及抗生素的藥敏試驗結果

圖1 5種藏藥及14種抗生素耐藥率對比結果

2.2 五種復合藏藥耐藥譜型分析結果及多重耐藥結果 14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對5種復合藏藥的藥敏檢測結果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌中有4株腸出血性大腸桿菌表現為3重耐藥,有1株腸出血性大腸桿菌表現為4重耐藥,有3株表現為5重耐藥(表4、圖2)。

2.3 動物試驗結果 14株牦牛源腸出血性大腸桿菌的動物致病性試驗結果可以看出,只接種攻毒液沒有注射仁青芒覺的分離菌株均能引起大多數小鼠死亡,均具有高致病性,致死率達到95%,而注射了仁青芒覺復合藏藥的試驗組,死亡情況明顯降低,從死亡小鼠實質器官中均能分離回收到與攻毒用相同的細菌,在麥康凱瓊脂培養基上形成典型的紅色菌落,回收得到的細菌涂片染色表現為革蘭陰性小桿菌,菌體兩端著色較深,符合大腸桿菌的特征。

表4 14株腸出血性大腸桿菌對5種藏藥的耐藥譜分析

圖2 5種藏藥的多重耐藥性分析

3 討論

腸出血性大腸埃希菌是一群重要的能夠引起人類致病的食源性病原菌,主要寄生在反芻動物腸道內,是一種人獸共患傳染病的病原,可以引起人的血樣腹瀉、出血性結腸炎和溶血性尿毒綜合征。溶血性尿毒綜合征主要表現為腎臟衰竭、溶血性貧血及血小板減少等[13]。通常人們認為病原菌攜帶毒力因子才會具有致病性,檢測這些毒力因子可以有效地分辨出任意1株大腸桿菌是否具有潛在的致病能力[14]。動物試驗結果可以看出：只接種攻毒液沒有注射仁青芒覺的分離菌株均能引起大多數小鼠死亡,均具有高致病性,致死率達到95%,而注射了仁青芒覺復合藏藥的試驗組,死亡情況明顯降低。這說明仁青芒覺這味復合藏藥對牦牛源腸出血性大腸桿菌有一定的抑制作用,我們認為大腸桿菌病的治療方面除了臨床上常用的抗生素,復合藏藥也是一個很不錯的選擇,特別是在耐藥性日趨肆虐的今天,就顯得很有研究價值。

14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對5種復合藏藥的藥敏檢測結果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對仁青芒覺表現為中度敏感;對石榴健胃丸、十五味黑藥丸、仁青二十五味馬寶丸、仁青芒覺均表現為耐藥。而14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對14種常見抗生素的藥敏檢測結果顯示：14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對萬古霉素、青霉素、紅霉素表現為耐藥,對呋喃妥因表現為中毒敏感;對氯霉素、諾氟沙星、萬古霉素、頭孢唑啉等10種抗生素均表現為敏感。雖然從試驗結果看出這5種藏藥對腸出血性大腸桿菌病的抑菌效果并不如常用抗生素的抑菌效果好,但是這并不能說明藏藥對腸出血性大腸桿菌病沒有一定的治療效果。由于廣譜抗菌藥的濫用以及細菌間耐藥基因的轉導等因素,導致耐藥菌增多,尤其是大腸桿菌對常用抗菌藥物耐藥的發展越來越令人擔憂[15]。因此我們要尋求抗生素以外的抑菌產品,就顯得尤為重要,這也是本文研究藏藥對腸出血性大腸桿菌抑菌活性的意義。

現如今,國內乃至國際上對于腸出血性大腸桿菌病的治療沒有有效的方法[16],特別是在耐藥性泛濫的形勢下,我們可以適當選擇這種復合藏藥進行治療,從我們本次試驗中就可以看出,仁青芒覺這種藏藥對腸出血性大腸桿菌有一定的抑制作用,所以我們認為選擇藏藥來治療腸出血性大腸桿菌病是切實可行的,特別是在耐藥性問題日趨嚴重的今天,顯得尤為重要。臨床用藥時應避免交叉耐藥的藥物同時使用,不僅起不到治療效果,還會進一步的促進耐藥性的產生。此外,臨床用藥應注意交叉用藥,輪換用藥,穿梭用藥減少耐藥性的產生[17]。

仁青芒覺主要成分是降香、沉香、訶子(去核)、天竺黃、西紅花、檀香、體外培育牛黃、人工麝香、熊膽、琥珀、松石、坐臺等140味,據傳統藏藥醫書記載其中松石、麝香、人工牛黃等具有清熱解毒、抑制病毒的作用[9],試驗首次從其清熱解毒的藥理作用出發對仁青芒覺進行體外抑菌活性研究,結果表明14株牦牛源腸出血性大腸桿菌對仁青芒覺表現為中度敏感,其余4種藏藥均無明顯抑菌作用。