1例雞源血清4型禽腺病毒感染的實驗室診斷

李榮旭,曹夢蕊,伍輝吉,張溢珊,劉敏芳,陳濟鐺,陳建紅,張濟培

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院,廣東 佛山 528231)

禽腺病毒(FAdV)屬于一種無囊膜的雙鏈DNA病毒,可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群。Ⅰ群、Ⅱ群禽腺病毒與火雞出血性腸炎和相關病毒等疾病關系較為密切,Ⅲ群禽腺病毒與產蛋下降綜合征相關[1]。Ⅰ群禽腺病毒分為A～E 5個基因型,5個基因型包含12個血清型(血清1型為基因A型,血清5型為基因B型,血清4型為基因C型,血清2、3、9、11為基因 D 型,血清 6、7、8a、8b為基因 E 型)[2]。FAdV-4是心包積水-肝炎綜合征的主要病因[3]。1987年,巴基斯坦首次報道雞群發生該病,隨后在印度、科威特、伊朗、日本等國也相繼報道雞群暴發該病[4]。2015年,我國湖北、山東、河南等地暴發以心包積水、肝炎為主要特征的疾病,發病雞群表現為突然死亡,死亡率為20% ～50%,病雞剖檢可見心包積液和肝炎[5-6]。目前,該病已成為一種嚴重危害養雞業健康發展的傳染病。本試驗對某雞場病死雞作樣品采集,通過臨床癥狀、病理剖檢、病毒分離、PCR檢測、序列測定分析、病理組織觀察和動物回歸試驗等系列診斷后,確診該病病原為FAdV-4。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病雞為廣州番禺某雞場送檢病死雞。

1.2 實驗動物和雞胚 SPF雞胚,購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司,由本實驗室自行孵化至9日齡使用。1日齡肉雞10只,購自南海某雞場,未作任何免疫處理。由本實驗室自行飼養至28日齡使用。

1.3 主要培養基與試劑 DNA抽提試劑盒,Proteinase K、Premix E × Taq、DNA Marker DL-2 000、pMD18-T載體連接試劑盒和DH5α感受態細胞,均購自TaKaRa公司;膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒是Omega公司產品;瓊脂糖為Biowest公司產品;氨芐西林鈉鹽、Goldview核酸染料、瓊脂粉和 Tris base,購自廣州永津生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)等,按常規配制。麥康凱瓊脂培養基,購自廣州環凱微生物科技有限公司;液體石蠟、甲醛、無水乙醇、鹽酸、二甲苯、冰醋酸、中性樹膠,均購自天津市大茂化學試劑廠。

1.4 引物設計與合成 參考GenBank上已發表的FAdV Hexon基因序列,利用Oligo 7.0軟件設計特異性引物 P1：5′-CGTCCTTCAAGCCCT-3′,P2：5′-GTGATACAGCAGGTTAATGAA-3′,引物由生工生物工程(廣州)股份有限公司合成。

1.5 方法

1.5.1 病料的采集與處理 無菌操作采集病死雞肝、脾、胰等組織。稱重病料重量,按1 g病料加5 mL雙抗PBS的比例,充分研磨均勻后,反復凍融3次,12000 r/min離心10 min,取上清液,檢驗是否無菌,-80℃保存備用。并分別采集肺臟、肝臟組織浸泡于4.0%甲醛溶液48 h,按常規對組織制作切片和染色觀察。

1.5.2 病毒的分離與純化 取上述病料處理保存的上清液,0.2 mL/枚接種于9 d的SPF雞胚卵黃囊,37℃繼續孵育。棄24 h死亡雞胚,收集24～96 h內死亡的雞胚尿囊液,將收集的雞胚尿囊液進行血凝試驗(HA),根據β微量稀釋法作病毒的HA,收集的雞胚尿囊液盲傳3代,置-80℃保存備用。

1.5.3 病毒DNA提取和PCR鑒定 按照TaKaRa公司Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0的使用說明書提取病毒DNA,提取物進行PCR擴增。利用針對Hexon基因設計的特異性引物對提取的病毒DNA進行PCR擴增。PCR擴增總體積為20 μL,其中 ddH2O 10 μL,2×PCR E ×Taq聚合酶6 μL,上下游引物各1.5 μL,病毒DNA模板為1 μL。 PCR 反應條件：95℃ 5 min;98℃ 10 s,53℃ 30 s,72℃30 s,共 30個循環;72℃ 10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

1.5.4 Hexon序列的測定 按照1.2.3步驟抽提病毒DNA進行PCR擴增,擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,陽性產物經膠回收試劑盒(按說明書操作)進行回收,回收產物與pMD18 T-Vector連接并轉化至DH5α感受態細胞,挑取陽性克隆菌體送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,應用DNAStar軟件對序列進行相似性分析,并應用MEGA 7.0繪制進化樹。

1.5.5 動物回歸試驗 取上述經純化并經PCR鑒定為FAdV-4的雞胚尿囊液,經胸部肌肉注射0.5 mL雞胚尿囊液/只,攻毒10只4周齡的健康肉雞,并設對照組,用生理鹽水做同樣處理。觀察并記錄發病雞的死亡數、臨床癥狀和剖檢病變。

2 結果

2.1 病雞剖檢 病雞見心包積液(淡黃色),肝臟腫脹變性、質脆,肺充血、水腫,腎腫脹、充血等病變(見中插彩版圖1)。

2.2 病毒尿囊液HA試驗 病毒經雞胚增殖純化后作HA試驗檢測,結果顯示,該病毒不能凝集雞或鴨的紅細胞,表明該病毒無凝集雞或鴨的紅細胞特性。

2.3 PCR鑒定 應用FAdV的Hexon基因設定特異性引物對病毒雞胚尿囊液提取的DNA進行PCR鑒定,產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,在分子量為500～750 bp處出現特異性目的條帶(見圖2),大小與預期目的片段相符。

圖2 Hexon基因PCR擴增結果

2.4 序列分析 結果顯示,分離株B13的目的基因擴增序列與GenBank數據庫中的FAdV最相近。參考序列基因經MEGA 5.0軟件構建序列進化樹(見圖3),由圖3可見,分離株與基因C型的3株FAdV-4的相似性為100.0%,與其他血清型的相似性較低,進一步確定該毒株為基因C型血清4型禽腺病毒。

圖3 測序結果經與FAdV Hexon基因代表序列的相似性比較

2.5 動物回歸試驗 試驗動物經攻毒4 d后出現精神沉郁,食欲下降,5 d開始出現死亡。剖檢見心包內積淡黃色膠胨樣液體,肝臟腫脹、變性,肺充血、水腫以及腎腫脹、充血(見中插彩版圖4),病理組織學切片鏡檢,見心臟肌纖維斷裂并有少量炎性細胞浸潤;肝細胞變性、壞死,有炎性細胞浸潤并可見嗜堿性包涵體;肺水腫,肺房大量滲出液蓄積;腔上囊淋巴濾泡結構疏松,淋巴細胞和網狀細胞變性壞死、核固縮(見中插彩版圖5)。

3 小結與討論

禽腺病毒呈世界性分布,各年齡段家禽均易感染。2015年以來,在國內山東、安徽、廣東等地區暴發以雛雞心包積液,肝臟腫脹、出血,腎臟腫脹、出血為主要特征的傳染病,經研究證實病原為FAdV-4[7]。該病發病較急,主要感染雞群為3～5周齡雛雞,死亡率在20% ～80%,給我國養雞業的健康發展造成了嚴重的影響。本試驗對某雞場病死雞作樣品采集,通過臨床癥狀、病理剖檢、病毒分離、PCR檢測、序列測定分析、動物回歸試驗和病理組織學觀察等系列診斷后,確診該病病原為FAdV-4。

據資料顯示,一些腺病毒毒株感染可引起腔上囊、胸腺和脾臟中的淋巴細胞缺失,可造成免疫抑制[8]。本試驗通過動物回歸試驗作病理組織學觀察,發現試驗攻毒雞腔上囊濾泡結構疏松紊亂,淋巴細胞和網狀細胞變性壞死,數量減少,核固縮,提示該病可對免疫器官造成損傷,導致免疫抑制。

禽腺病毒的Hexon是病毒主要的衣殼蛋白,含有型、群和亞群特異性抗原決定簇[9,10]。本試驗通過對分離株Hexon基因序列測定分析表明,分離毒株B13與AH712、ZK、SDNY1-15等FAdV-4參考毒株100%相似,進一步確定該分離株為FAdV-4。