犬骨骼標本制作中脫脂工藝的試驗

呂 旭,劉 甜,蒲思斯,劉 琦,李嘉成,毛 飛,邵良庸,陳世昌,王彩云

(1.內蒙古農業大學獸醫學院 農業部動物臨床診療技術重點實驗室,內蒙古 呼和浩特 010018;2.內蒙古五原縣農牧業局,內蒙古 五原 015100)

犬的骨骼標本不僅可以生動形象的展現它的骨骼結構和形態,體現犬的不同進化狀態,而且可以作為直觀的教具,起到活躍課堂氛圍,增強學生理解能力的作用[1-2],在實際教學過程中起到其他教具不可替代的作用,還可以不受時間、地點的限制為科研提供方便,對獸醫診療人員的臨床工作也能起到較大的指導作用,所以骨骼標本對教學、科研和實踐的作用是其他教具無法替代的。骨骼標本制作的步驟主要包括：清除軟組織、脫脂、漂白和串接等,在此過程中能否徹底脫去骨骼中的油脂是制作優質骨骼標本的關鍵。十二烷基苯磺酸鈉(C18H29NaO3S,簡稱LAS),是一種陰離子表面活性劑,其使用廣泛[3],在制作骨骼標本的過程中,我們使用0.02%LAS溶液、3%NaOH溶液、95%酒精(C2H6O)3種不同的試劑對犬骨骼標本進行了脫脂處理,下面將試驗結果和試驗分析做一介紹,為犬骨骼標本制作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗器械：解剖剪、解剖刀、脫脂棉、紗布、電磁爐、鐵鍋、電鉆、自制0.5 mm～1.0 mm鉆頭、恒溫箱。

實驗藥品：30%過氧化氫溶液(H2O2)、氫氧化鈉(NaOH)、十二烷基苯磺酸鈉(C18H29NaO3S,簡稱LAS)、95%酒精(C2H6O)。

實驗動物：6歲齡拉布拉多犬1只(體重32 kg),5.5歲齡靈緹犬1只(體重30 kg),6.5歲金毛犬1只(體重35 kg),動物均來自內蒙古農業大學實驗動物園。

1.2 方法

1.2.1 動物預處理 剝皮、摘除內臟、剔除肌肉組織：將死亡后的犬仰臥放置于剖解臺上,及時進行剝皮,從腹正中線切開皮膚,逐漸向兩側分離,在肛門等自然孔及指關節末端進行環切。剝離皮膚后打開腹腔,取出全部內臟器官后,沖洗軀體上的血漬,放入-20℃冷凍。待實驗條件成熟取出解凍,剔除肌肉組織。在腕骨、籽骨等處剔肉時要格外小心,防止小的骨骼在處理過程中丟失。肋骨處應注意保持軟骨的完整性,避免損傷肋軟骨。先將四肢從軀干分離,然后從頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎將軀干骨分成五部分進行后續處理。頭部處理時應先摘除眼球,將顱腔內的大腦用鑷子攪碎后用脫脂棉擦拭取出[4],重復2～3遍,后用清水沖洗。

1.2.2 煮制脫脂 剔除肌肉后,在長骨的隱蔽處打孔至骨髓腔內[5]、小塊骨骼用紗布袋分裝[6],放入鍋中,加水煮沸,隨時觀察煮制液表面油脂的漂浮情況,記錄不同時間不同部位的煮制效果,以附著在骨骼上的小塊肌肉及肌腱等是否容易剔除,或自動脫落且不傷害軟骨組織為度[7]。煮制完成后的骨骼繼續剔除殘留的肌肉肌腱等,然后用清水沖洗2遍,陰干待用。

1.2.3 化學試劑脫脂 我們將煮制好的拉布拉多犬的骨骼放入0.02%LAS溶液,靈緹犬的骨骼放入95%酒精,金毛犬的骨骼放入3%NaOH溶液進行脫脂,記錄相同溫度和時間下3種脫脂劑對骨骼的脫脂效果。在脫脂后的10、20、30 d和60 d觀察骨骼表面的油漬滲出情況,最后確定最佳脫脂劑,用清水沖洗2遍,陰干待用。

1.2.4 漂白 用毛刷蘸取30%H2O2溶液涂刷脫脂后的骨骼,每隔30 min刷洗1次并觀察效果,依據不同部位不同骨質的骨骼,適當增減涂刷次數,以骨骼漂白到理想的效果為度,漂白后的骨骼用清水沖洗2次,自然晾干即可串接固定。

1.2.5 串接固定 將頭部、頸椎、胸椎、腰椎、薦椎、尾椎和四肢依次打孔串接[5、13],肋骨與胸椎,胸骨與肋骨串接,指骨、籽骨等不能打孔的小骨骼用膠水粘接牢固。串接固定前先確定好骨骼之間的角度,避免串接后姿態異常影響美觀。串接完畢后,擺好標本的姿態,用支架將骨骼標本固定于底座上,蓋上防塵罩。

2 結果

2.1 自來水煮制試驗結果 將3只犬分別放入盛有自來水的鍋中煮制,根據不同部位的骨骼一般需要1 h～3.5 h不等,本次試驗根據煮制過程中骨骼的骨塊完整程度、殘肉粘附度等為具體指標進行評價,結果見表1。

表1 犬骨骼煮制脫脂試驗結果

由表1看出,不同部位骨骼煮制效果最佳的時間為：頸椎、胸椎、腰椎3.0 h;肋骨、尾椎2.5 h～3.0 h;掌骨、指骨、趾骨等小骨骼煮制2.5 h;四肢骨、骨盆腔和頭骨2 h～3 h;胸骨和劍狀軟骨1.5 h。經觀察,在暗處打孔的長骨在煮制1 h左右就有大量油脂漂浮于煮制液表面,對骨髓腔內脫脂起到了一定的效果。

2.2 化學試劑脫脂試驗結果 在25℃ ～30℃室溫下,將煮制好的拉布拉多犬的骨骼放入0.02%LAS溶液(A組),靈緹犬的骨骼放入95%酒精(B組),金毛犬的骨骼放入3%NaOH溶液(C組)進行脫脂,不同時間點的脫脂結果見表2,犬骨骼脫脂后保存結果見表3。

表2 犬骨骼化學試劑脫脂試驗結果

表3 犬骨骼脫脂后保存結果

根據表2和表3結果綜合分析得出,LAS在48 h脫脂即可達到理想的效果,且在保存30 d內無油脂滲出,而95%C2H6O脫脂48 h未達到脫脂目的,3%NaOH溶液在48 h雖然達到了脫脂目的,但對骨骼有了一定程度的損壞。

3 討論

3.1 犬骨骼標本制作個體的選擇 在制作骨骼標本的過程中,犬個體的體重和骨質的堅硬程度決定了骨骼標本的質量,因此,對個體的選擇非常關鍵。對于犬,如果年齡太小[8],骨塊沒有完全愈合,骨連接處軟骨較多,在煮制、脫脂、漂白過程中易脫落且很難拼接,制作完成后的骨骼標本形態結構不明顯,標本失去研究價值;若年齡過大,骨質疏松,在制作過程中及日后的保存容易被損壞。體重應選擇中等偏瘦的犬,偏胖的犬脂肪較多,脫脂較困難,如果太瘦,骨骼的整體形態突顯較差。因此應選擇5～7歲齡且中等偏瘦的犬,此年齡段的犬骨塊完全愈合,骨末端的軟骨較結實,且骨質堅硬,最適合制作骨骼標本。

3.2 自來水煮制脫脂試驗 實踐證明,較難剔除的組織若強力剔除,會損壞骨面,經過煮制后,這些組織會緊縮或者自然脫落,易于剝離。同時,煮制的過程中也會起到一定的脫脂作用。長骨在隱蔽處打孔[5、13]后,脫脂效果更佳,在煮制1 h左右就會有大量油脂滲出,同時此步驟減少了化學試劑脫脂的時間。另外,根據骨塊的大小和骨骼的結構,不同部位骨骼的煮制時間也各有不同,胸骨、劍狀軟骨等煮制1 h左右即可,時間不可過長,否則會變形變脆影響骨骼的正常形態;椎骨和長骨體積較大,且椎骨結構較復雜,長時間煮制后,附著組織基本會自然脫離,一般煮制3 h～3.5 h,有利于后期的處理;小骨骼及肋骨應分裝后煮制,如四肢應分別裝袋[6]后煮制,這樣既會避免骨骼丟失,也會方便后期處理。

3.3 化學試劑脫脂試驗 經過長期的實踐,傳統的有機溶劑脫脂[9]效果雖好,但缺點較多,如二甲苯刺激性大、劇毒,汽油、酒精等易燃易爆,安全性較低,近年應用于骨骼標本制作的香蕉水脫脂[10]成本相對較高,NaOH溶液又有腐蝕性,脫脂過程中對骨骼易產生損害,且需要不斷觀察,掌握不好脫脂濃度和時間就會對骨骼標本造成不可挽回的損害。經過長期試驗,我們認為LAS廉價高效、低毒環保、不易氧化,是一種優良的骨骼標本脫脂劑,LAS與酒精、氫氧化鈉在相同溫度相同時間下進行對比試驗的結果證明,LAS在犬的骨骼標本制作中可以代替傳統的有機溶劑或氫氧化鈉進行脫脂。

LAS是一種陰離子表面活性物質,對水的硬度較敏感,在硬度低的水中活性高,脫脂能力較強,用蒸餾水配制后效果較好,強于用自來水配制的溶液,生物降解度＞90%[11]。目前常作為洗調劑、金屬脫脂劑、樹脂分散劑等許多方面的單獨成分或配合成分,其具有去污、脫脂、乳化、分散等性能。LAS應用于骨骼標本脫脂的優點：(1)易于購買,相對于有機溶劑和NaOH溶液來說更為安全環保,成本更低;(2)溶于蒸餾水后液體清亮,脫脂過程中會變的越來越渾濁,所以可根據液體的渾濁程度來判斷脫脂情況;(3)脫脂的速度快,對于犬的骨骼來說,在25℃～30℃下0.02%的LAS溶液僅需48 h左右便可完成整個脫脂過程,且在后期保存過程中沒有油脂滲出的情況。在試驗過程中,根據骨骼體積的不同,脫脂時間也可適當增加或縮減。但LAS對皮膚有輕度刺激性[12],長時間接觸后會有輕微皮膚干燥、皸裂等,操作時戴橡膠手套、口罩、穿工作服即可。