患子宮內膜炎母豬陰道菌群變化與發(fā)病關系研究

黃安妮,閆 鶴

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東 廣州 510641)

母豬子宮內膜炎癥是目前規(guī)模化豬場較為常見生殖道疾病之一[1],該病發(fā)病率高,50%以上的母豬繁殖性疾病是由子宮內膜炎引起的[2]。該病一般是由于病原菌進入母豬子宮內,黏附在子宮黏膜破損處,引起母豬子宮黏膜表層或深層發(fā)生黏液化或者化膿性炎癥[3],患病母豬會在陰道或外陰處發(fā)現(xiàn)有粘性或膿性分泌物[4]。患子宮內膜炎癥會嚴重影響母畜發(fā)情周期,導致屢配不孕,即使偶爾配上也會產弱豬、死胎、木乃伊胎或假孕,造成巨大的經濟損失,嚴重影響豬群的健康[1]。

準確掌握母豬生殖道內的菌群結構情況對更好地、有針對性的治療母豬子宮內膜炎至關重要[5]。陰道是一個開放性腔道,是重要的微生態(tài)區(qū)系,有眾多的微生物棲居于此,正常陰道腔內的微生物與宿主、環(huán)境保持著協(xié)調的、動態(tài)的平衡[6]。相關研究表明,陰道微環(huán)境平衡對維持其自凈及宿主健康起著重要作用[7],是宿主抵御致病菌或條件致病茵的一道重要的生物學屏障[8]。

到目前為止,豬的陰道微生物群通常只通過細菌培養(yǎng)確定,然而,自然環(huán)境中只有不到1%的微生物能用常規(guī)培養(yǎng)方法檢測到[9],同時由于母豬陰道菌群多為厭氧菌或兼性厭氧菌[10],營養(yǎng)要求苛刻,因此使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以全面地認識陰道菌群分布[11]。隨著高通量測序技術的出現(xiàn),使得微生物組學的研究更加全面和準確。本文利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對健康產仔后母豬和患子宮內膜炎母豬的陰道菌群進行分析,以探究患子宮內膜炎母豬陰道可能存在的病原。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2017年9月廣東省某規(guī)模化豬場多頭母豬出現(xiàn)產仔后準備再次受孕時陰道流膿現(xiàn)象,隨機取其中3頭母豬的陰道黏液,用無菌陰道棉拭子于陰道取分泌物,避免接觸到陰道口和外陰部以防污染,取出后立即放入2.0 mL無菌離心管中,將離心管放入干冰中,帶回實驗室保存在-80℃冰箱,提取總基因時取出。用同樣的陰道拭子采集方法收集同一豬場產后體況良好、無子宮內膜炎和繁殖病史的母豬陰道樣本10份。

1.2 DNA抽提和PCR擴增 利用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN,Germany)提取微生物總DNA,DNA濃度和純度利用NanoDrop 2 000進行檢測,DNA質量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測;用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對 V3 ～V4可變區(qū)進行PCR擴增,擴增程序為：95℃預變性3 min;然后95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共27個循環(huán);最后72℃延伸10 min(PCR儀：ABI GeneAmp?9 700型)。 擴增體系為 20 μL,4 μL 5?FastPfu 緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL 引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu 聚合酶;10 ng DNA模板。

1.3 Illumina Miseq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺(Illumina,San Diego,USA)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。利用 Illumina公司的 MiseqPE300平臺進行測序。

1.4 數(shù)據處理與分析 原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控,用FLASH軟件進行拼接：去除質控后長度低于50 bp的序列;引物允許2個堿基的錯配,去除模糊堿基;根據重疊堿基Overlap將兩端序列進行拼接,Overlap需大于10 bp,去除無法拼接的序列。利用UCHIME軟件剔除嵌合體,采用RDP classifier(置信度閾值為0.7)對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。選擇Silva作為參考基因組數(shù)據庫。使用Mothur軟件計算樣本Alpha多樣性指數(shù)。基于Bray-Curtis算法計算樣本間距離,并根據該距離對樣本進行主坐標分析(PCoA)。利用Wilcoxon rank-sum test檢驗方法檢測兩組母豬陰道微生物群落物種差異顯著性。

2 結果

2.1 產仔后健康母豬與患子宮內膜炎母豬陰道菌群多樣性比較 13份陰道拭子樣本經測序后共得到628 807條有效序列數(shù),序列平均長度為413.12 bp,群落覆蓋度超過99.19%,表明所有樣本的測序深度足夠,可以反映樣本的微生物信息。兩組樣本Alpha多樣性分析如表1所示,Sobs,Ace和Chao指數(shù)用來估算樣品中微生物豐富度,與健康組相比,患子宮內膜炎組陰道菌群豐富度水平升高,且兩組間有顯著性差異(P＜0.001)。同時,表中Shannon指數(shù)對比說明患病組母豬陰道菌群的多樣性高于健康組。基于Bray-Curtis距離的PCoA分析(Principal co-ordinates analysis)比較兩組的群落結構差異。主坐標成分(PC1,PC2和PC3)占有70.59%的樣本組成差異,表明健康母豬與患子宮內膜炎母豬的陰道菌群組成是可以相互區(qū)分的,而組間個體微生物菌群組成相似(見封三彩版圖1)。

表1 兩組樣本Alpha多樣性分析

2.2 菌群群落結構門水平組成分析 在門水平,健康組共鑒定出5個相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌門,患病組鑒定出8個優(yōu)勢菌門,見封三彩版圖2A。健康組中厚壁菌門(Firmicutes)占總數(shù)的55.14%,其次擬桿菌門(Bacteroidetes)占15.89%,變形菌門(Proteobacteria)占14.40%,放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)分別為9.90%和3.59%,優(yōu)勢菌門豐度總計可達到98.92%。患子宮內膜炎組的優(yōu)勢菌門有：變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和未分類菌門(Unclassified_k_norank),平均相對豐度分別為73.49%、7.89%、5.24%、4.34%、1.94%、1.86%、1.65%和1.44%,合計占總細菌量的97.84%。其中患子宮內膜炎母豬陰道菌群中的變形菌門顯著高于健康母豬陰道樣本(P＜0.05),而厚壁菌門和梭桿菌門的相對豐度顯著低于健康樣本(P＜0.05)(見封三彩版圖3A)。

2.3 菌群群落結構屬水平組成分析 在屬水平總共檢測到了794種菌屬,其中健康組共有546種,患病組有571種。相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬在健康組與患病組中各有23種和10種,其中僅有葡萄菌屬為共同優(yōu)勢菌屬,在健康組占比為3.23%,低于疾病組的3.85%(見封三彩版圖2B)。健康組的鏈球菌屬是其陰道菌群內含量最高的菌屬,占總數(shù)的 7.04%,梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、擬桿菌屬(Bacteroides)、放線桿菌(Actinobacillus)和幽門螺旋菌(Terrisporobacter)也在健康組高表達,且相對豐度均顯著高于患子宮內膜炎樣本(P＜0.05)見封三彩版圖3B。患病組中Burkholderia-Paraburkholderia的相對豐度最高,達41.65%,顯著高于健康組。除Burkholderia-Paraburkholderia外,僅有沙雷菌屬(Serratia)、腸桿菌科-未分類(unclassified_f__Enterobacteriaceae)和葡萄球菌屬等少數(shù)菌屬在患病組中的豐度顯著高于健康組(P＜0.05)(見封三彩版圖3B)。

3 討論

本試驗利用Illumina高通量測序技術分析患子宮內膜炎母豬陰道菌群結構特征,發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生伴隨著陰道微生物菌落組成結構的顯著變化。研究結果發(fā)現(xiàn),患病組母豬陰道菌群多樣性與豐富度指數(shù)均高于健康組,表明患子宮內膜炎母豬陰道菌群結構更為復雜。類似的,許蘇容等[11]運用高通量測序對育齡期女性陰道菌群多樣性進行分析,發(fā)現(xiàn)健康育齡期女性菌群多樣性顯著高于細菌性陰道病患者。

本研究揭示出健康母豬陰道菌群在門水平上主要富集厚壁菌門,擬桿菌門,變形菌門,放線菌門和梭桿菌門,這5個菌門是Lorenzen等的研究中健康G?ttingen迷你豬陰道菌群的優(yōu)勢菌門[10],結果也與Jun Wang等對健康母豬陰道菌群的研究相似[4]。患子宮內膜炎后的母豬,變形菌門占比顯著增加,而該門包含有大量致病菌,例如Escherichia,Shigella,Burkholderia[12]。除變形菌門外,其余4個健康組的優(yōu)勢菌門在患病后相對豐度均相應降低,這與Jun Wang等[4]的研究結果存在一定差異,Jun Wang等在對4頭健康母豬與4頭患子宮內膜炎母豬陰道菌群測定時發(fā)現(xiàn)：厚壁菌門在健康組中相對豐度顯著高于疾病組,變形菌門在患病組樣品中上升為優(yōu)勢菌門,擬桿菌門和梭菌門在患病組的相對豐度均要高于健康組。不同實驗室測定結果的不一致,可能與豬品種即遺傳背景、飼養(yǎng)環(huán)境及飼料的營養(yǎng)標準不同有關。

一般認為,引起母豬子宮內膜炎的致病菌為葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、大腸桿菌(Escherichia Coli)等[13-15]。Jun Wang等[4]分析患子宮內膜炎母豬陰道菌群,也發(fā)現(xiàn)在患病組中埃希氏-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、葡萄球菌屬等含量均高于健康組。然而本研究結果顯示,鏈球菌屬、大腸志賀氏菌屬在健康組中占比更高,葡萄球菌屬在兩組間含量相近,因此,我們認為該批次母豬子宮內膜炎癥不是由上述3種致病菌引起的。進一步研究發(fā)現(xiàn),Burkholderia-Paraburkholderia在疾病組的平均相對豐度高達41.65%,在健康組中檢出率為0,是患病組中檢測到的特有菌屬,可能是導致該批次母豬患子宮內膜炎的主要原因。伯克霍爾德氏菌(Burkholderia)包含大量菌種,包括許多與臨床、植物相關的病原菌,以及與環(huán)境相關菌種[16]。伯克霍爾德氏菌近年被一些研究進一步細分為Burkholderia,Paraburkholderia兩種菌屬,與臨床、植物相關的病原菌可歸為Burkholderia,與環(huán)境相關菌可歸為Paraburkholderia[16]。本研究未細分到菌種,因此用Burkholderia-Paraburkholderia概述。伯克霍爾德氏菌中部分菌種可引起感染病和炎癥等[17-18],在人陰道菌群的報道中就發(fā)現(xiàn),fungorum伯克霍爾德氏菌(Burkholderia fungorum)可能是和人的細菌性陰道炎相關的細菌[19-20]。這是首次發(fā)現(xiàn)Burkholderia-Paraburkholderia可能是引起母豬的子宮內膜炎的主要因素。

綜上所述,本研究通過高通量測序技術發(fā)現(xiàn)了患子宮內膜炎母豬與健康母豬陰道菌群的差異,其中Burkholderia-Paraburkholderia豐度的增加可能與母豬的子宮內膜炎癥密切相關。研究為患子宮內膜炎癥母豬的預防及治療提供依據。